椰子ZF-HD基因家族的鉴定及生物信息学分析.docx

椰子ZF-HD基因家族的鉴定及生物信息学分析 孙熹微 范海阔 弓淑芳 刘蕊 纠凤凤 肖勇摘 要：ZF-HD蛋白是一类只存在于植物体内且含有锌指结构域的转录因子家族，其不仅能够调节植物的生长发育，且在植物响应逆境过程中也起着重要的作用本研究通过比对已开发的椰子基因组数据，共鉴定出20个椰子ZF-HD蛋白采用生物信息学的方法，对其基因结构、蛋白理化性质、蛋白质保守结构域、超二级结构、系统进化树及表达谱进行分析结果显示：椰子ZF-HD蛋白多为碱性蛋白，且主要定位于细胞核、叶绿体及线粒体中椰子ZF-HD基因家族可分为6个亚族，每个亚家族都具有相似的结构域和超二级结构motif搜索分析显示，CoMIF亚族只含有锌指结构域保守序列，其他亚族均含有锌指结构域序列与同源异形盒结构域序列表达谱分析显示，CoZHD18、CoZHD20在测序的各组织中表达较少，其他家族成员在各组织中的表达量具有差异性关键词：ZF-HD基因家族;椰子;生物信息学：S667.4;Q786 ：AAbstract： ZF-HD protein is a family of transcription factors that contain zinc finger domains and only exist in plants. It not only regulates the growth and development of plants， but also plays an important role in floristic response to stress. In this study， 20 ZF-HD proteins of coconut were identified by comparison with the developed coconut genome database. Bioinformatics methods were used to analyze its genic structure， protein physicochemical properties， protein conserved domains， motifs， phylogenetic trees and expression profiles. The analysis showed that the coconut ZF-HD proteins are mostly basic protein. And they are mainly located in the nucleus， chloroplast and mitochondria. The coconut ZF-HD gene family could be divided into 6 subfamilies， each of which had similar structural domains and super secondary structures. The motif search analysis showed that the CoMIF subfamily only contained the zinc finger domain conserved sequence， and the other subfamilies contained the zinc finger domain sequence and the homeobox domain sequence. And expression profiling revealed that CoZHD18 and CoZHD20 were not detected in the sequenced tissues， and the expression levels of other family members in each tissue were different.Keywords： ZF-HD gene family; coconut; bioinformatics同源异型盒基因广泛存在于生物体中，其最早于1984年在果蝇中发现[1]，之后又在其他生物中陆续发现。

同源异型盒基因参与生物个体生长发育的调控过程，但在植物发育中起到的作用也不尽相同例如：拟南芥WUS基因参与拟南芥子房发育成型与侧生器官形成的调控[2]，而拟南芥中ZHD1基因参与拟南芥的抗逆表达，提高拟南芥逆境中的抗性[3]锌指蛋白是一种Zn2+与氨基酸螯合形成的具有手指状结构域的转录因子其广泛存在于所有生物體中，最早于1983年在非洲爪蟾蟾（Xenopus laevis）的卵母细胞的转录因子TF母细胞中发现[4-5]Berg等[6]通过锌指蛋白中组氨酸（His）与半胱氨酸（Cys）残基位置与个数的不同将锌指蛋白分为C2H2、C2HC、C6、C8、C2HC5、C3HC4、C4HC3、C2C2和CCCH共8种锌指蛋白能够与目标DNA[7]、RNA[8]、DNA-RNA杂交双链[9]相互作用或与其他锌指蛋白、自身之间[10]相互作用，从而调控蛋白的转录及翻译ZF-HD（zinc finger-homeobox）基因家族的显著特点是含有1个锌指结构域和1个同源异形盒结构域，广泛地存在于陆生植物中[11]该类蛋白在细胞凋亡以及基因转录的调控过程中起着关键的作用[12]椰子是棕榈科椰子属单子叶多年生乔木[13]，具有很高的经济价值及药用价值。

椰水中含有丰富的脂肪、蛋白质、维C以及人体必须的微量元素，经常饮用可强心、清暑、利尿椰肉可以用来制作糕点、菜肴，椰香浓郁椰油中含有大量的月桂酸，长期食用可降低人体固醇含量，提高身体免疫力，有效预防疾病椰壳更是可入药，对心绞痛、癣症、梅毒有特殊功效[14]目前关于椰子的研究较少，且还没有对椰子ZF-HD基因家族进行深入的生物信息学分析本研究通过拟南芥ZF-HD基因家族蛋白保守序列比对椰子基因组序列，获得椰子ZF-HD基因家族序列，并对该家族成员的保守结构域、三维结构和进化关系等方面进行了初步的生物信息学分析，同时通过表达谱分析该家族成员在椰子不同部位的表达量，为进一步研究椰子ZF-HD基因家族提供依据1 材料与方法1.1 椰子ZF-HD基因家族的鉴定在（GIGA）nDB（http：//gigadb.org/dataset/100?347？ tdsourcetag=s_pc_aiomsg）上下载已经拼接好的椰子基因组数据从TAIR（https：//www.arabi?dopsis.org/）数据库中下载拟南芥ZF-HD 基因家族基因号，在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/）数据库中下载拟南芥ZF-HD基因家族中基因对应的蛋白序列。

之后将拟南芥ZF-HD基因家族蛋白序列与椰子基因组数据进行TBLASTN比对（E值≤1对LA10）所得结果去掉重复项，将其序列翻译后在Pfma（http：//pfam.xfam.org/ search）数据库中进行结构域的预测，去除不含有结构域的序列再使用ExPASy-ProtParam（https：// web.expasy.org/protparam/）工具对获得的蛋白序列进行分子量、等电点和氨基酸数的预测使用WoLF PSORT工具对获得的蛋白序列进行亚细胞定位分析1.2 构建进化树依照检索对比所得到的基因的内含子、外显子信息，利用GSDS 2.0（http：//）绘制内含子与外显子组成图并使用Clus?talW软件对获得的蛋白序列与拟南芥ZF-HD基因家族序列进行多序列比对将得到的结果输入MAGA7软件中，采用邻接法构建进化树，校检次数（Bootstrap）为1000次1.3 超二级结构预测与三级结构同源建模利用GeneDoc序列分析软件对比得到的椰子ZF-HD基因家族蛋白序列进行多序列比对分析再利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/ meme）工具对比得到的椰子蛋白序列与拟南芥ZF-HD基因家族序列进行motif搜索。

在SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy. org/）上進行蛋白质三级结构同源建模1.4 基因家族表达分析在NCBI数据库中下载不同品种椰子叶片（SRR1063404、SRR1063407、SRR1125016、SRR?1173229、SRR1273180）与椰子胚（SRR?12?73070）、胚乳（SRR1265939）及胚愈伤组织（SRR1137438）的转录组数据用FPKM（Fragments Per Kilobase Million）的计算方法标准化paired-end测序的转录组数据依照Trapnell等[15]提供的算法，公式如下：式中，F为fragment，l（t）为transcript长度检索后得到比对所得基因在不同品种椰子叶片、胚、胚乳以及胚愈伤组织中的FPKM值，并以l g函数处理FPKM值，之后将数据导入MeV软件构建基因表达谱2 结果与分析2.1 椰子ZF-HD基因家族的鉴定及理化性质与亚细胞定位分析本研究用拟南芥ZF-HD基因家族的基因序列比对椰子基因组数据，去掉重复项后得到20条椰子基因序列之后用MAGA7软件将得到的序列翻译为蛋白序列，在Pfma数据库中进行结构域的预测。

结果显示，20条序列均含有ZF-HD蛋白二聚区结构域将20条椰子ZF-HD基因家族基因序列按照其基因ID排序从CoZHD1～CoZH?D20最后，对椰子ZF-HD基因家族进行了蛋白理化性质的分析以及亚细胞结构的定位，结果如下（表1）从表1中可以看出，椰子ZF-HD基因家族的蛋白质等电点在6.78～9.66之间，其中仅有CoZ?HD8、CoZHD19等电点小于7，而其他18个家族成员均为碱性蛋白质分子量在10012.12～ 75156.63Da之间，分子量最小的是CoZHD2，而CoZHD8的分子量远大于家族中其他成员，为其他家族成员的2～3倍CoZHD8的氨基酸数目最多，为670 aa，而CoZHD2的氨基酸数目最少，为91 aa通过亚细胞定位分析发现，椰子ZF-HD基因家族20个家族成员均分布在细胞核、线粒体与叶绿体中，而在叶绿体、线粒体中均有功能蛋白翻译这也与ZF-HD基因家族蛋白的基因调控功能相吻合2.2 椰子ZF-HD基因家族与拟南芥ZF-HD基因家族进化树分析依照与椰子基因组数据对比所得椰子ZF-HD基因家族家族成员的内含子、外显子信息，利用GSDS2.0绘制内含子与外显子组成图。

再将其蛋白序列与拟南芥ZF-HD基因家族成员蛋白序列进行多序列比对，将得到的结果输入MA?GA7软件中，采用邻接法构建椰子ZF-HD基因家族进化树与椰子、拟南芥ZF-HD基因家族系统进化树（图1）图1、图2根据Hu等[12]对拟南芥ZF-HD基因家族亚家族的分类，从构建所得的进化树中，可将拟南芥与椰子ZF-HD基因家族分为7个亚家族（表2），分别为ZHDⅠ、ZHDⅡ、ZHDⅢ、ZHDⅣ、ZHDⅤ、MIF、UK（unknown）将椰子ZF-HD基因家族分为6个亚家族（表3），分别为CoZHDⅠ、CoZHDⅡ、CoZHDⅢ、CoZHDⅣ、CoMIF、UK进化树显示，ZHDⅢ亚族中没有椰子ZF-HD基因家族成员这是由于拟南芥为双子叶植物而椰子单子叶植物，而ZHDⅢ亚族中均为双子叶植物UK亚家族的功能尚不知晓，其功能还尚待研究在椰子ZF-HD基因家族中有85%（17个）的基因不含有内含子，只有外显子这也与Irish[16]对拟南芥ZF-H。