供体淋巴细胞在GVHD模型小鼠组织器官中迁移和分布的动态观察【医学论文】.doc

医学论文-供体淋巴细胞在 GVHD 模型小鼠组织器官中迁移和分布的动态观察作者：温宏升，王健民，周虹，夏荣，邱慧颖，高磊，胡晓霞【摘要】 本研究应用小鼠 GVHD 模型探讨异基因 T 淋巴细胞在移植受体体内的迁移和分布将 C57BL/6 的骨髓细胞和转基因荧光 C57BL/6 小鼠的脾淋巴细胞输入经 8 Gy 全身照射的 BALB/c 小鼠，建立 eGFP 标记供体淋巴细胞的 GVHD 小鼠模型；应用荧光显微镜和流式细胞术观测 GVHD 模型中 eGFP+细胞的分布；ELISA 法检测 GVHD 靶组织中趋化因子 MIP-1α 水平的改变结果表明：①输入脾细胞和骨髓细胞第 8 天后出现 GVHD 临床及病理表现;②GVHD 模型中，受体鼠肝、皮肤、肠、脾、肺、舌有 eGFP+ 细胞浸润;③GVHD 小鼠肝、脾 eGFP+ 细胞中 CD4+ 、CD8+ 细胞比例均逐渐升高;④GVHD 鼠脾、肝组织中 MIP-1α 水平升高，脾中 MIP-1α 水平高峰出现于移植后第 3 天，肝中 MIP-1α 水平高峰出现于移植后第 7 天结论：除肝、肠、皮肤外，肺、舌可能也是 GVHD 靶器官肝、脾组织中供体淋巴细胞浸润伴随 MIP-1α 水平的升高。

【关键词】 小鼠 GVHD 模型; T 淋巴细胞；增强型绿色荧光蛋白；巨噬细胞炎症蛋白Migration and Distribution of Allogeneic T Lymphocytes in Organs of Graft-Versus-Host Disease Mouse ModelAbstractThis study was aimed to investigate the migration and distribution processes of allogeneic donor T lymphocytes in the organs of recipient mice. GVHD model was established by transfusion of the splenocytes of eGFP transgeneic C57BL/6 mice together with born marrow cells harvested from C57BL/6 mice into BALB/c mice underwent 8.0 Gy total body irradiation. The migration and homing of eGFP+ cells were tracked by stereo-fluorescent microscopy or inverted fluorescent microscopy and flow cytometry. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was performed on supernatants from the tissue homogenates to detect the amount of MIP-1α. The results indicated that GVHD clinical manifestation and pathological changes of organs appeared on day 8 post transplantation. eGFP-positive donor T cells in recipient organs were observed by inverted fluorescence microscope in frozen section, or by stereo-fluorescence microscopy in living organs, such as liver, spleen, skin, lungs, bowels, and tongue. The highest expression of MIP-1α was on day 7 post transplantation in the liver (491.3±32.1 pg/ml), and day 3 post transplantation in the spleen (881.5± 45.2 pg/ml)，respectively (P1.0×109/L 并具有以下症状者为 GVHD 发生:倦怠、纳差、体重减轻、弓背、乱毛、脱毛、腹泻甚至死亡。

以25 天为观察期限，观察小鼠的 GVHD 发生情况和生存时间取肝、肠、皮肤组织,用 4%中性甲醛固定,石蜡包埋，常规切片,HE 染色,光学显微镜下观察eGFP+ 淋巴细胞在小鼠体内的分布取 A 组小鼠，麻醉后，去毛，切开鼠胸腹部，暴露肝、脾、肠、肺、肾，皮肤、舌、脑、骨等用 Leica MZFLⅢ 立体荧光显微镜观察，拍照，曝光时间 0.4-1.9 秒取 A 组小鼠，麻醉，PBS 灌注后，切取小鼠的肝、脾、单个肾脏、肠、皮肤、肺、脑实质、舌、肾脏等，冰冻切片（厚 10 μm），在Olympus Ⅸ 70 倒置荧光显微镜下观察绿色荧光以未输入 eGFP 细胞小鼠的各组织及冰冻切片分别作对照，排除背景荧光MIP-1α 水平和 T 细胞亚群检测取肝、脾、单个肾脏，置于 200 目不锈钢网中轻轻碾碎，以 1 ml PBS 分别收集细胞， 500×g 离心 6 分种，取上清，行 MIP-1α ELISA 检测，按试剂盒说明书操作，测 450 nm OD 值采用 Curve Expert1.3 软件作标准曲线，计算样本 OD 值对应的浓度值流式细胞术检测肝、脾、肾细胞悬液中 eGFP+ 细胞百分数及以 eGFP+ 细胞设门的 CD4+、CD8+ 细胞百分数。

统计处理数据用 SPSS 10.0 统计软件处理, 生存分析采用 Kaplan-Meier 分析方法；样本均数间比较采用独立样本 t 检验　　结果小鼠骨髓细胞和脾细胞中 CD4+ 、CD8+细胞百分比检测结果见表 1由表 1 可见，eGFP-Tg-C57BL/6 小鼠脾细胞（SC）悬液中CD4+ T 或 CD8+ T 淋巴细胞含量与 C57BL/6 小鼠相似，CD4+ T 均在 20％左右，CD8+ T 均在 13％左右 据此推测两种小鼠在引发 GVHD 方面没有区别这两种小鼠骨髓细胞中 T 淋巴细胞含量均极少，约为 2％因此，单输骨髓细胞可能不足以引发 GVHD移植后造血重建移植后第 3 天 WBC 降至最低值，第 8 天后 WBC 恢复至大于 1.0×109 ，第13 天 WBC 恢复至 3.0×109 以上移植后第 13 天后 C 组鼠的骨髓细胞大多为eGFP+细胞(图 1)，说明其来源于供体 eGFP-Tg-C57BL/6 鼠染色体检查显示受者雌性小鼠骨髓细胞 10 个分裂相中，8/10-10/10 可见 Y 染色体Table 1. Percentages of CD4+,CD8+ cells in bone marrow cells (BMC)and splenocytes(SC) of the mice（略）eGFP+ 淋巴细胞在小鼠体内的分布立体荧光显微镜、荧光倒置显微镜观察显示，A 组小鼠肝、皮肤、肠、脾、肺、舌有 eGFP+细胞浸润(图 2)；肾、脑、骨、心肌、骨骼肌等组织中均未见eGFP+细胞浸润。

可见肝、皮肤、肠、肺、舌等组织第 13 天 eGFP+细胞多于第3 天而脾组织第 13 天 eGFP+细胞少于第 3 天(图 3)GVHD 表现及转归A 组小鼠移植后第 8 天开始出现 GVHD 表现,主要为消瘦、弓背、脱毛、乱毛、体重减轻和腹泻,最后全部在 25 天内死亡出现 GVHD 表现小鼠的肝、肠符合急性 GVHD 的病理改变: 肝组织显着水肿，细胞浊肿、变性,可见灶性坏死，汇管区淋巴细胞浸润； 肠组织学表现黏膜脱落，腺体及绒毛水肿、坏死、糜烂，可见淋巴样圆形细胞浸润（图 4）单输骨髓细胞的 B 组小鼠无 GVHD 表现，肝、肠结构基本正常A 组、B 组小鼠生存曲线比较表明，A 组小鼠生存率明显小于B 组小鼠(图 5) (P<0.05)第 3、7、13 天， eGFP+ 细胞比例，在肝细胞悬液中逐渐增多，从18.4±3.4%升高至 70.8±5.3%；脾细胞悬液中逐渐减低，从 60.7±8.3%降低至27.8±4.3%肝、脾 eGFP+ 细胞中 CD4+ T、CD8+ T 淋巴细胞比例均逐渐升高（表 2）Table 2. Percentages of eGFP+ cells in the cell suspensions and percentages of CD4+ ,CD8+ cells in eGFP+ cells (略)肝、肾及脾脏中 MIP-1α 的表达与肾脏中 MIP-1α 水平相比，肝、脾中 MIP-1α 水平显着升高（P<0.05）;移植后第 3 天脾 MIP-1α 水平最高，为 881.5± 45.2 pg/ml，肝中 MIP-1α 高峰水平出现在第 7 天，达 491.3±32.1 pg/ml (图 6)。

讨论本研究将 C57BL/6 鼠骨髓细胞与转 eGFP 基因的 C57BL/6 鼠脾细胞一起植入经 8.0 Gy 照射的 BALB/c 鼠体内，成功建立了 GVHD 模型eGFP 可作为标记，用荧光显微镜或流式细胞仪可以直接检测供体 T 淋巴细胞在受体鼠体内的浸润、扩增情况本实验系统可用于观察供体细胞的分布及动态变化，为 GVHD 的发生机理及防治研究提供了方法平台 目前认为，激活的 CD4+ T 淋巴细胞分泌免疫应答发生必需的细胞因子，激活 CD8+ T 淋巴细胞，使其成为细胞毒性 T 淋巴细胞，从而攻击受者细胞引发 GVHD［1，2］在本实验模型中，由于供者小鼠骨髓中 T 淋巴细胞含量极少，单纯输注供者骨髓细胞，虽然也能实现植入和供者型造血重建，但无 GVHD 发生同时输注异基因脾细胞可使受者小鼠发生GVHD，在 GVHD 靶器官中出现受者 T 淋巴细胞的浸润和增殖我们观察到受者脾与肝中 eGFP 细胞呈现不同的动态变化：肝中 eGFP 细胞逐渐增多，而脾中 eGFP细胞逐渐减少这一结果提示，供体 T 淋巴细胞在移植初期可能先进入脾等淋巴器官，在异基因抗原作用下，激活、扩增后，离开脾，进入肝、肠等 GHVD 靶器官。

但不能排除肝、皮肤、肠等 GHVD 靶器官中存在供体 T 淋巴细胞的激活与扩增例如最近有学者研究表明，供体 T 淋巴细胞可在肝、脾、肺中直接与抗原呈递细胞相互作用而激活、扩增［3］经典 GVHD 靶器官主要是肝、肠和皮肤组织，GVHD 的临床分级也主要根据这 3 个组织的损伤程度临床资料表明，GVHD 与移植后的许多并发症均有联系，如间质性肺炎、黏膜炎症或溃疡、出血性膀胱炎、味觉丧失等有研究显示，脑、肾、牙龈、结缔组织、舌、鼻腔等组织中均可见供体淋巴细胞浸润，并将它们称之为非经典 GVHD 靶器官［4-6］本研究采用荧光显微镜观测 eGFP+ 细胞的分布，在肝、肠、皮肤、肺、舌中发现 eGFP+ 细胞浸润，这提示除肝、肠和皮肤等传统 GVHD 靶器外，肺、舌也是潜在 GVHD 靶器官我们在肾、脑、肌肉等组织中未观察到明显的 eGFP+ 细胞浸润，可能与肾、脑中供体淋巴细胞浸润较少或实验观测方法的敏感性有关MIP-1α 是一种重要的趋化因子，活化后的 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、单核细胞和肥大细胞均可产生 MIP-1αT 淋巴细胞有 MIP-1α 的受体 CCR5、CCR7 等的表达，MIP-1α 对 T 淋巴细胞有趋化作用［7］。

有研究表明，异基因造血干细胞移植的动物的肝、脾组织中 MIP-1α,。