酶工程：动植物细胞培养产酶.ppt

动植物细胞培养产酶,酶 工 程,,与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺一、植物细胞培养产酶,全世界用其制备天然芳香化合物的价值超过15亿＄/年； 美国用其生产药物超过30亿＄/年； 我国使用的中草药及其制备大部分来自植物； 主要生产色素、药物、香精、酶等次级代谢物植物细胞发酵产酶,在细胞膜外，由纤维素构成功能：1.支持细胞，使它有固定形状2.保护细胞,叶绿体：内有叶绿素，进行光合行用,植物细胞通常有较大的液泡,,,,1.植物细胞培养,植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养增殖，获得大量细胞的一种技术植物细胞具有的特性,细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，抗剪切能力低； 生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素； 细胞培养需氧，而培养液粘度大，且不能强力通风搅拌； 产物在细胞内且产量低； 细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培养的难度等二、植物细胞培养的特点,例如：紫草宁的生产，发酵细胞中的紫草宁比紫草根中高10倍紫草宁的结构,（1）提高产率,（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。

（3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有害物质污染和侵蚀 （5）其它 设计植物细胞生物反应器和控制工艺条件时应注意一些问题三、植物细胞培养的工艺条件及其控制,,（一）植物细胞培养的工艺流程,1、外植体的选择与处理,外植体是指从植株取出，经过预处理后，用于植物组织和细胞培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块； 选择无病虫害、生长旺盛的植株； 切成小块，消毒，漂洗,水稻的外植体（幼胚）,2、植物细胞的获取,（１）直接分离法：通常有机械法、酶解法；,机械法 具体做法： 将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化 从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团 优点： 细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究酶解法 酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂 优点 可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）2、植物细胞的获取,（１）直接分离法，有机械法、酶解法； （２）愈伤组织诱导法； （３）原生质体再生法,愈伤组织： 将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。

水稻的愈伤组织（幼胚）,1、植物细胞培养基的特点 （1）需要大量无机盐，除P、S、K、Ca、Mg外，还需B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、I （2）需要多种维生素和植物生长激素，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、分裂素等 （3）一般为无机氮源 （4）一般以蔗糖为碳源二）植物细胞培养的培养基,2.几种常用的植物细胞培养基 几种常见的培养基是：MS、B5、White等3、植物细胞培养基的配制,（三）温度的控制 室温（25℃） （四）pH值的控制 微酸性（pH5～6） （五）溶解氧的调节控制 代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜强烈 （六）光照的控制 （七）前体的添加 提高次级代谢物的产量 （八）刺激剂(electior)的应用 强化次级代谢产物的生物合成常用微生物细胞壁碎片和胞外酶四、植物细胞培养产酶的工艺过程,SOD是生物体内清除超氧化物阴离子自由基(O 2—)的重要金属酶类它和过氧化氢酶、过氧化物酶一起构成了生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维护生物体内细胞正常的生理代谢和生化反应衰老自由基学说认为衰老源于机体正常代谢过程中产生过量的自由基对机体损害的结果超氧化物歧化酶(SOD)作为能催化超氧阴离子发生歧化反应的自由基清除剂，具有延缓衰老的作用。

天瑞SOD苹果,以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例,(1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次2)大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d3)酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶二、动物细胞培养产酶,动物细胞可产生较高价值的物质,特别是激素、疫苗，单克隆抗体和酶等动物功能蛋白。

动物细胞模式图,一、动物细胞的特性,（1）无细胞壁,脆弱; （2）体积比微生物细胞大几千倍,稍小于植物细胞; （3）具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性、功能全能性； （4）营养要求复杂二、动物细胞培养的特点 （1）主要用于生产各种功能蛋白质； （2）生长缓慢； （3）需加抗生素防污染； （4）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感； （5）具锚地依赖性，宜贴壁培养；部分用悬浮培养； （6）培养基成分复杂，反应过程成本高，产品价格贵 ； （7）原代细胞培养50代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞三、动物细胞培养的方式,来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞等非锚定依赖性细胞采用 类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较大差别杂交瘤细胞悬浮培养,（一）悬浮培养,细胞悬浮培养法的优点,可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害 细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养注意事项,培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及一定速度通入含5％CO2的无菌空气，保持细胞悬浮态并维持培养液溶解氧。

此外不同细胞悬浮条件亦异，为使细胞不致凝集、成团或沉淀，在配制培养基的基础盐溶液中不加钙和镁离子间歇或连续更换部分培养液，可维持pH值，若使用HEPES缓冲盐溶液时尚可不必连续通入含5％CO2空气大多数动物细胞，采用: （1）滚瓶培养系统: 结构简单,重现性好;,（二）贴壁培养,将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法称为微载体培养法 由葡聚糖凝胶制成微球,动物细胞依附其上单层生长繁殖,悬浮于培养液中; 特点:比表面积大,单位体积培养液细胞产率高;具有悬浮培养的优点2）微载体系统:,制备微载体的材料主要有： 葡聚糖（DEAE—Sephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素,四、动物细胞培养的工艺条件及其控制,种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞； 工艺过程：,种质细胞,胰蛋白酶,悬浮细胞,悬浮培养或贴壁培养,收集培养液、分离纯化,,,,（一）动物细胞培养基组成成分,1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用； 2、维生素：血清中，B族和维C； 3、无机盐：调节渗透压； 4、葡萄糖：作为碳源和能源； 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松； 6、生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。

二）动物细胞培养基的配制,首先配制各类母液，使用前混合过滤除菌，使用时稀释至所需浓度； 各种动物培养基已商品化三） 温度的控制,一般控制在36.5℃; 温度也会影响pH值四）pH值的控制,一般控制在pH7.0～7.6; 培养过程中需要对pH值进行监测和调节； 采用CO2和NaHCO3溶液调节:需注意溶解氧的控制；流加酸碱液； 加入缓冲系统； 监测指示剂为酚红五）渗透压的控制,培养液渗透压应与细胞内的渗透压处于等渗状态六）溶解氧的控制,溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要； 采用调节混合气体的量与比例的方法五、动物细胞培养产酶的工艺过程,以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂(tPA)为例： tPA是一种丝氨酸蛋白酶,可以催化纤溶酶原水解，生成纤溶酶;纤溶酶催化血栓中的血纤维蛋白水解，对血栓性疾病有显著疗效生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程,１、人黑色素瘤细胞培养基； ２、人黑色素瘤细胞培养； ３、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化动、植物细胞培养与微生物培养区别,动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。

动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制 植物细胞对营养要求较动物细胞简单但由于植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求三者之间的差异主要有： 植物细胞动物细胞微生物细胞 动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长 植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单 植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感 植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同动植物细胞培养产酶,,与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺植物细胞结构,一、植物细胞培养产酶,1.植物细胞培养的特点,植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养增殖，获得大量细胞的一种技术2.培养基特点 应用最广的是MS培养基和LS培养基 MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基LS培养基是在其基础上演变而来的。

3.培养方法：悬浮细胞培养 ①细胞株的建立；外植体与愈伤组织 ②扩大培养； ③大罐培养；,外植体： 从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块 愈伤组织： 将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织,外植体,愈伤组织,4. 培养条件的影响与控制 （1）温度 （2）pH （3）通气与搅拌 （4）光照的控制 （5）前体的添加（饲喂） （6）刺激剂（elector）的应用,5.植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例 (1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次2)大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。

然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，2。