讲义-动物微生物学实验指导.doc

动物微生物学实验指导指导教师：郭春秋 李娜目 录实验1　细菌的简单染色和革兰氏染色实验2　细菌的芽胞、荚膜、鞭毛染色及运动性观察实验3 微生物细胞形态及菌落特征观察实验4　培养基制作、灭菌消毒及无菌操作接种技术实验5　微生物的分离纯化与稀释平板菌落计数实验6　微生物细胞大小测定及显微镜直接计数附录1 常用培养基配方附录2 常用染色液的配制附录3 常用试剂和指示剂的配制参考书目实验1　细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1、 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法；2、 学习显微镜油镜观察的方法；二、实验内容1、 细菌的简单染色；2、 细菌的革兰氏染色；三、实验原理　　简单染色法是一种最基本的染色方法，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红）等进行染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使菌体着色简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色反应。

通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类这是因为两类菌的细胞壁结构和成分的不同，G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经过蕃红复染后就成红色G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，即紫色四、实验材料1、活材料：培养12～16h的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培养24h 的大肠杆菌（Escherichia coli）2、染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲苯、香柏油五、实验用品废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、滴管、玻片搁架、镊子、无菌水、75%乙醇浸泡的消毒棉球、盛有75%乙醇的玻片回收缸、生物显微镜等六、实验方法（一）简单染色1、涂片：用消毒棉球擦拭双手，用镊子取干净载玻片一块，在载玻片的左、右两端各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金芽胞杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。

再取干净载玻片一块，挑刚制成的苏云金芽胞杆菌浓菌悬液2～3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2～3环涂在右边制成薄涂面亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多2、晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干★是否还有其它方法？3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定，以不烫手为宜★为什么要进行该步骤？4、染色：用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1～2min5、水洗：水洗去涂片上的染色液6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，勿将菌体擦掉7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态★怎样操作才能做到既快而又不易损坏玻片地调准焦距？（二）革兰氏染色1、涂片：涂片方法与简单染色涂片法相同★涂片厚薄对结果有影响吗？2、晾干：与简单染色法相同3、固定：与简单染色法相同4、结晶紫初染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量的结晶紫染色液染色1min，以盖满细菌涂面为宜之后倾去染色液，用水小心地冲洗 5、碘液媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min后用水洗去碘液。

★此步可否省去？ 6、脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇，脱色20～25s至流出液无色，立即水洗★为什么要立即水洗？7、复染：滴加蕃红复染2～5min，然后用水洗去涂片上的番红染色液 8、晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干9、镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性10、实验完毕后的处理⑴ 将浸过油的镜头按下述方法擦试干净:①先用擦镜纸将油镜头上的油擦去；②用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2～3次；③再用干净的擦镜纸将镜头擦2～3次，注意擦镜头时向一个方向擦试⑵ 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，并放入盛有75%乙醇溶液的回收缸中⑶ 显微镜复原并做好使用情况登记七、作业与思考（一）、绘图1、 简单染色后绘出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）的形态图2、 革兰氏染色后绘图并注明金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）两菌的革兰氏染色的反应性。

二）思考题1、 在取菌涂片的过程中怎样操作才能保证斜面菌种不受到污染？2、 革兰氏染色反应成败的关键操作是哪一步？为什么？3、 为什么革兰氏染色法要选用幼龄菌种？实验2　细菌的芽胞、荚膜、鞭毛染色及运动性观察一、实验目的1、 学习并掌握细菌芽胞染色法，初步了解芽胞杆菌的形态特征；2、 学习并掌握细菌荚膜染色法；3、 学习并初步掌握细菌鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征；4、 学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性二、实验内容1、 细菌芽胞染色；2、 细菌荚膜染色；3、 细菌鞭毛染色；4、 细菌的运动性观察三、实验原理细菌的芽胞壁较细胞壁厚而致密，透性低，不易着色，也不易脱色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色，芽胞呈无色透明状芽胞染色法就是基于细菌的芽胞和菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行着色，使芽胞和菌体呈现不同的颜色而加以区别所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色当芽胞着色时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色再用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，形成鲜明的对照，便于观察荚膜是包在细菌细胞壁外面的一层黏胶状或胶质状物质，成分为多糖、糖蛋白或多肽，与染料间的亲和力弱，不易着色，故通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一浅色或无色的透明圈。

由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形，影响观察结果细菌的鞭毛极细，直径一般为10～20nm ,超过了普通光学显微镜的分辨力，只有用电子显微镜才能观察到但是，如采用特殊的染色法，将鞭毛直径加粗，则在普通光学显微镜下也能看到它鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定重要特征之一采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦如果只需查清供试菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法即压滴法，直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛此法较快速、简便悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察细菌依赖鞭毛的运动方式，与鞭毛的排列形式和数目有关，但根据细菌的运动方式，对鞭毛的数目和排列方式只能作大致判断单毛菌和丛毛菌多做直线运动，周毛菌多做翻转运动。

依赖鞭毛的运动称为真性运动无鞭毛细菌做左右颤动而不改变其位置，这种运动称为非真性运动，亦称布朗运动四、实验材料1、活材料：培养36h的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）；培养3～5d的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”），该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚；培养12～16h 的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae ），黏质赛氏杆菌（Serratia marcescens ）或荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens ）斜面菌种；培养12～16h的枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）以及荧光假单胞菌（Pseudomonas Fluorescens）2、染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液；Tyler法染色液、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液、黑素、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CUSO4水溶液；硝酸银染色液（包括A液和B液，）、Leifson 染色液；香柏油、二甲苯。

五、实验用品小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、载玻片、凹载玻片、盖玻片、滴管、废液缸、玻片搁架、接种环、擦镜纸、吸水纸、镊子、记号笔、洗瓶、凡士林、无菌水、水浴锅、生物显微镜等 六、实验方法（一）细菌芽胞染色1、改良的Schaeffer和Fulton氏染色法⑴制备菌液：加1～2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液★为什么要制成浓稠的菌液？⑵加染色液：加5%孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合⑶加热：将此试管浸于沸水浴，加热15～20min⑷涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干⑸固定：将涂片通过酒精灯火焰3次⑹脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止⑺复染：加番红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干⑻镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色2、Schaeffer与Fulton氏染色法⑴涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片⑵晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2～3次⑶染色：①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后，将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持15～20min。

加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸★加热时温度可否太高？②水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止③复染：用番红液染色5min④水洗、晾干或吸干⑤镜检：先低倍、再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态结果：芽胞呈绿色，菌体为红色二）细菌荚膜染色细菌荚膜染色方法很多，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌如用相差显微镜检查则效果更佳1、负染色法⑴制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取2～3环菌体放入水滴中混匀并涂布⑵干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干★为什么不能在火焰上方烘干？⑶染色：在涂面上加复红染。