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Southern blot 实验方法与步骤用于检测重组 DNA ，也可分析 DNA 样品中是否有与探针序列同源的 DNA 片段用于基因 诊断，也可验证检测片段的分子量大小将基因组 DNA 经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖 电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的 DNA 经碱变性处理，将凝胶中变性的 DNA 转移至一固相支持滤膜利用标记的某一 DNA 、 RNA 或寡核苷酸与固着于滤膜上的 DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测一） 器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或 80 C烤箱，摇床，X线胶片二） 试剂：限制性内切酶， DNA 加样缓冲液， DNA Ladder Marker ， 0.25M HCl ，变性 液（ 0.5M NaOH ， 1.5M NaCl ），中和液（ 0.5M Tris- HCl PH7.5 ， 3M NaCl ）, 转印迹液 20XSSC （3M NaCI , 0.3M柠檬酸钠，PH7.0 ）,标记探针， 2XSSC ,预杂交液和杂交液，2X洗液（2XSSC,0.1%SDS ） ,0.5 洗液（0.5 爲SC,0.1%SDS）,1 X 缓冲洗液（0.1M 马来酸， 0.15M NaCI ,PH7.5,0.3%Tween20 ） ,1 X寸阻液[1 % （W/V）封阻剂溶于 1 X马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5 ） ], 1 X检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5 ）,抗—地高 辛－碱性磷酸酶。

三）步骤：1、 酶切（以单一酶为例）设置反应体系（反应体系 30卩l） ddH20 5卩l基因组DNA （0.5g/l） 2l短暂离心，消除离心管内气泡，于 37 C消化过夜注意：若基因组 DNA 过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉 淀、浓缩 DNA 片段，加少量 DNA 加样缓冲液点样2、 消化好的样品点样于 0.7%琼脂糖凝胶进行电泳； 注意：为保证 DNA 均匀分散于加样孔，应缓慢将样品加至加样孔3、 电泳结束后，将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性，室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶 0.25M HCl 10 —15 min蒸馏水摇洗 5 min变性液 40 min 蒸馏水摇洗 5 min 中和液 15 min， 2次；4、 在凝胶碱变性的同时，制备转印迹装置 Southern blot 转膜技术有三种： 1 ），毛细管转移法； 2），电转移法； 3），真空转移法这里介绍最经典的毛细管转移法（向上转移） ，在转印迹槽中，倒入 20XSSC 溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上从下向上依次 置入：两张与凝胶等宽的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中（简称 “桥”），底面在上的凝胶，滤膜（与凝胶等大） ，滤纸（与凝胶等大） ，吸水纸（略小于滤纸， 5— 8cm 高）， 400—800g 重物。

凝胶四周用 Parafilm 膜包围防止短路 滤膜事先用 2XSSC 浸湿至 少 5 min 滤纸事先用 20XSSC 浸湿转膜 4— 18 小时；注意： 转膜装置中各层滤纸和膜之间要将气泡赶净 一旦建立转膜系统后， 要防止滤膜和凝 胶错位防止吸水纸倒塌和完全湿透，要及时更换吸水纸5、 转膜结束后，取出滤膜，边角剪一小角做标记滤膜于 2XSSC 摇洗 5min ，用滤纸吸 干；6、用紫外交联照射（正面朝上）或于 80 C烤箱烘烤0.5 — 2小时；7、 膜可立即进行预杂交和杂交，或保存于 4C待以后应用；8、 预杂交和杂交1 ） 将杂交膜浸湿于 6XSSC 2min ，同时预热预杂交液和杂交炉至预杂交温度；2） 杂交膜封于杂交袋，按 0.2ml/cm 2 膜面积加入预杂交液，预杂交至少 1 小时；3） 用于 southern blot 的探针可分为 DNA 探针、 RNA 探针和寡核苷酸探针对探针的标 记方法又可以分为放射性标记和非放射性标记 这里主要介绍非放射性地高辛标记探针的杂 交方法杂交时各种探针的用量： DNA探针，5 — 25ng/ml ; RNA探针，100ng/ml ;寡核苷酸探针，0.1 — 10pmol/ml。

双链DNA探针提前100 C变性10min后迅速冰浴，单链探针无 需变性 将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度 杂交温度的选择根据杂交液的不同而 不同;注意：应用寡核苷酸探针时，杂交温度的选择 Tm = 4X（G+C）+2 X （A+T）,杂交温度比Tm低约10 C4）弃去预杂交液，将含探针的杂交液注入杂交袋，至少 3.5ml/10 X1C m，置入杂交炉滚动;9、 杂交后的洗膜处理过程，顺序如下：2X洗液 2X15min0.5 ＞洗液 2X15min1 x缓冲洗液 1 X3mi n1 x封阻液 1 X60min抗体液 * 1 x30min1x缓冲洗液2X15mi n1 x检测液1 X5mi n*抗—地高辛—碱性磷酸酶用 1X封阻液稀释10, 000倍（若用显色法稀释 5000倍；若用CDP-Star 检测用 20， 000 倍稀释）;10、 将膜浸于CSPD液（CSPD用1X检测液稀释100倍，CDP-Star也用1X检测液稀释 100倍）室温避光静置 5min ;回收剩余的 CSPD液或CDP-Star液避光保存于4 C可反复 应用 3— 5 次；11、 将膜上残液吸净，用保鲜膜封好于 37 C反应15min，然后将膜固定于压片夹，进行曝 光。

注意：若用显色剂检测，新鲜配置显色剂（ 45卩lNBT和35卩l BCIP溶于10ml 1 x检测液），将膜浸于显色剂中避光反应 4—16 小时，反应期间不要移动膜实验原理核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一 其基本原理是： 具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下， 可按碱基互补的原则形成双链， 此杂交过程是高度特 异的由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性， 综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分 析的结果，便可绘制出 DNA 分子的限制图谱但为了进一步构建出 DNA 分子的遗传图， 或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求， 还必须掌握 DNA 分子中基因编码区的大小和位置有关这类数据资料可应用 Southern 印迹杂交技术获得Southern 印迹杂交技术包括两个主要过程： 一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结 合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（ blotting ） ;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火， 即分子杂交过程 该技术是 1975 年英国爱丁堡大学的 E.M.Southern 首创的， Southern 印迹杂交故因此而得名。

早期的 Southern 印迹是将凝胶中的 DNA 变性后， 经毛细管的虹吸作用， 转移到硝酸纤维膜 上近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如 APT、ABM纤维素膜）等利用 Southern印迹法可 进行克隆基因的酶切、 图谱分析、 基因组中某一基因的定性及定量分析、 基因突变分析及限 制性片断长度多态性分析（RFLP）等实验方法本节以哺乳动物基因组 DNA 为例，介绍 Southern 印迹杂交的基本步骤一、 待测核酸样品的制备（一） 制备待测 DNA基因组 DNA 是从动物组织（或）细胞制备 1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织 匀浆器研磨破碎组织中的细胞； 2. 用蛋白酶和 RNA 酶消化大部分蛋白质和 RNA ； 3. 用有 机试剂（酚 /氯仿）抽提方法去除蛋白质二） DNA 限制酶消化基因组 DNA 很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶 消化 DNA 一般选择一种限制酶来切割 DNA 分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用 不同的限制酶消化基因组 DNA 切割 DNA 的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分 和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的 DNA 片段。

消化DNA后，加入EDTA , 65C加热灭活限制酶，样品即可直接进行电泳分离，必要时可进 行乙醇沉淀，浓缩 DNA 样品后再进行电泳分离二、 琼脂糖凝胶电泳分离待测 DNA 样品（一） 基本原理Southern印迹杂交是先将DNA样品（含不同大小的DNA片段）先按片断长短进行分离，然后 进行杂交这样可确定杂交靶分子的大小因此，制备 DNA 样品后需要进行电泳分离 在恒定电压下，将 DNA样品放在0.8〜1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电 泳可分辨 70－80000bp 的 DNA 片段，故可对 DNA 片段进行分离但需要用不同的胶浓度 来分辨这个范围内的不同的 DNA 片段原则是分辨大片断的 DNA 需要用浓度较低的胶， 分辨小片段 DNA 则需要浓度较高的胶琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的网状物质，具有分子筛作用在相应的电泳缓冲液中， DNA在电场的作用下由负极向正极泳动， 分子越大， 泳动速度越慢； 反之，分子小则泳动速度快， 而大小相同的分子则泳动速度相同因此在恒定的电场下，经过一段时间电泳后， DNA 按分子大小在凝胶中形成许多条带，大小相同的分子处于同一条带另外为了便于测定待测DNA 分子量的大小，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的 DNA 样品即标准分子量 DNA （DNA marker ）进行电泳。

DNA marker 可以用放射性核素进行末端标记，通过 这种方式，杂交后的标准分子量 DNA 也能显影出条带在制备凝胶和电泳过程中需要注意的几个问题是：第一、尽可能在使用之前配制新鲜凝胶；第二、如果使用的胶比较薄，铺胶后 1h内使用；第三、胶中不要含有 EB,否则会引起非特异性背景；第四、电泳结束后用1卩g/ml的EB染色，然后用水脱色（如果胶里含的是 RNA , 则使用无 RNA 酶的水），以保证核酸的完整性二） 基本步骤1. 制备琼脂糖凝胶，尽可能薄DNA 样品与上样缓冲液混匀，上样推荐使用的靶基因的上样量见下表：表 4－1 不同条件下上样本的使用指针比较表一般而言，对地戈辛杂交系统，所需DNA样品的浓度较低，每道加2.5-5 yg人类基因组DNA ;如果基因组比人类 DNA更复杂（如植物DNA ）则上样量可达10yg;每道上质粒 DNA<1 ng 2. 分子质量标志物（ DIG 标记）上样3. 电泳，使 DNA 条带很好的分离4. 评价靶DNA的质量在电泳结束后， 0.25-0.50卩g/mlEB染色15-30min，紫外灯下观察凝胶三、 电泳凝胶预处理(一) 原理DNA 样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。

为了进行有效地实现 Southern 印迹转移，对电泳凝胶做预处理十分必要分子量超过10kb的较大的DNA片段与较短的小分子量 DNA 相比，需要更长的转移时间所以为了使 DNA 片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必 须将最长的 DNA 片段控制在大约 2kb 以下 DNA 的大片段必须被打成缺口以缩短其长度 因此，通常是将电泳凝胶浸泡在 0.25mol/L 的 HCl 溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱 性溶液中浸泡，使 DNA 变形并断裂形成较短的单链 DNA 片段，再用中性 PH 的缓冲。