酶工程概述学习培训课件.ppt

酶酶工程概述工程概述酶工程(EnzymeEngineering)定义b研究酶的大量生产和应用的技术学科b食品酶工程酶在工业上应用受到限制的原因（1）不稳定、要求的条件不同；（2）分离纯化酶的技术繁琐、复杂；（3）酶制剂成本高，价格贵；问题1.增强酶的稳定性，拓展其用途2.提高酶的产量，降低成本（活性、含量、分离手段改进）7.17.1酶的生产与发酵酶的生产与发酵酶的生产与发酵酶的生产与发酵7.2酶的分离纯化酶的分离纯化7.3酶的固定化酶的固定化、酶传感器、酶传感器7.4 酶分子的酶分子的修修饰饰与改造与改造7.5酶酶的非水相催化的非水相催化7.6生物酶工程生物酶工程7.1酶的生产与发酵酶的生产与发酵利用微生物产酶优点微生物种类繁多，菌种资源丰富；微生物培养成本低廉；微生物生长迅速，且菌种易诱变,易于控制代谢方向；采用发酵技术，易于工业化生产；基因工程技术为微生物产酶提供了广阔的空间7.1.1发酵生产酶的菌种(1)非致病菌，安全性好2)菌种较稳定，不易退化，不易感染噬菌体3)工艺简单易行，发酵周期短，产酶量高，能利用低廉原料4)酶的分离纯化容易，最好使用胞外酶菌种对于产酶菌种的要求7.1.1.1酶制剂生产的菌种来源bb常用的微生物主要是细菌和真菌bb枯草杆菌是生产淀粉酶、蛋白酶常用的菌种。

bb大肠杆菌是谷氨酸脱羧酶和天冬氨酸酶的生产菌种bb常用的真菌包括黑曲霉、根霉、米曲酶以及酵母7.1.1.2酶制剂菌种的分离及培养（1）菌种的采集与分离（2）菌种纯化（3）菌种的培养7.1.2酶的发酵生产 微微生生物物酶酶的的发发酵酵生生产产是是指指在在人人工工控控制制的的条条件件下下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶有目的地利用微生物培养来生产所需的酶 培养基培养基发酵条件发酵条件发酵方式发酵方式生长繁殖生长繁殖产酶产酶7.1.2.1酶生产发酵的营养需求 五大要素五大要素碳源、氮源、无机盐、生长因子、水碳源、氮源、无机盐、生长因子、水7.1.2.2发酵条件及控发酵条件及控制制生长繁殖生长繁殖酶的形成酶的形成7.1.2.3酶发酵生产的方式 bb根据细胞培养方式的不同，分为bb固体发酵bb液体发酵bb固定化细胞发酵等酶催化某一化学反应的能力以单位时间底物的减少或生成物的增加来表示酶活力单位：酶活力单位：1IU（internationalunit)=1mol/min在特定条件下（最适pH值、25、最适底物浓度、最适缓冲液的离子强度），1min内，能转化1mol底物所需要的酶量酶活力酶活力酶活力大小酶活力大小 在实际中往往对不同的酶使用不同的酶活单位在实际中往往对不同的酶使用不同的酶活单位淀粉酶活力单位定义为:在60pH6.2条件下,每小时可催化1g淀粉所需要的酶量为一个单位（U).直接以光密度值表示：单位时间增加或减少0.001个光密度值为一个酶活单位（U)；例如溶菌酶、过氧化物酶自定义酶活单位指的是酶制剂催化能力的大小既与酶蛋白的浓度有关又与酶分子的催化能力大小有关。

在酶的研究和使用过程中，各酶制剂中的酶量一般用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即U/mg或U/mL酶量酶量指的是每毫克蛋白所具有的酶量表示酶的相对纯度，比活越高说明纯度越大表示为U/mg.Pro酶酶比活比活7.2酶的分离纯化酶的分离纯化1酶分离纯化的基本策略酶分离纯化的基本策略2酶分离纯化的方法酶分离纯化的方法3酶的剂型与保存酶的剂型与保存 7.2.1 酶分离纯化的基本策略 酶分离纯化的基本过程 1.材料的选择与预处理 2.粗分离 3.细分离 4.制剂 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩、干燥酶浓缩、干燥酶的制剂酶的制剂动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心，过滤，沉淀，萃取，层离心，过滤，沉淀，萃取，层析，电泳，萃取，结晶等分离析，电泳，萃取，结晶等分离技术技术酶纯化方案的设计酶纯化方案的设计完整的酶制备方案完整的酶制备方案酶活测定方法的建立酶活测定方法的建立材料的选择材料的选择预处理对酶性质的初步探索预处理对酶性质的初步探索制定酶的纯化程序制定酶的纯化程序酶成品的保存酶成品的保存建立酶的活性测定方法建立酶的活性测定方法特异、灵敏、精确、快速、经济特异、灵敏、精确、快速、经济分离纯化酶的三原则分离纯化酶的三原则1.防止酶的变性失活2.目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去3.酶具有催化活性，检测酶活性，能跟踪酶的行踪。

防止酶变性失活的方法防止酶变性失活的方法 1.1.操作都应在低温条件下进行，尤其是在有机溶操作都应在低温条件下进行，尤其是在有机溶剂存在的情况下剂存在的情况下2.2.大多数酶在大多数酶在pH4pH10pH10的情况下不稳定，的情况下不稳定，故必须控制整个系统不要过酸过碱；故必须控制整个系统不要过酸过碱；同时要避免在调整同时要避免在调整pHpH时产生局部酸碱过量的现象时产生局部酸碱过量的现象3.3.酶常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，酶常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成故操作中应尽量减少泡沫形成4.4.重金属等能引起酶失效，重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变性有机溶剂能使酶变性,微生物污染以及蛋白水解酶能使酶分解破坏微生物污染以及蛋白水解酶能使酶分解破坏酶分离纯化的方法酶分离纯化的方法物质间性质的差异物质间性质的差异设计的分离纯化的方法设计的分离纯化的方法溶解度的差异溶解度的差异盐析法盐析法/有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法/等电点淀等电点淀法法/共沉淀法共沉淀法/选择性沉淀法选择性沉淀法/结晶结晶稳定性的差异稳定性的差异热变性法热变性法/酸碱变性法酸碱变性法/表面变性法表面变性法电荷性质的差异电荷性质的差异吸咐交换分离法吸咐交换分离法/电泳分离法电泳分离法聚焦层析法聚焦层析法/电渗析分离法电渗析分离法分子大小和形状的差异分子大小和形状的差异透析法透析法/超滤法超滤法/凝胶过滤法凝胶过滤法离心分离法离心分离法/膜分离法膜分离法亲和作用的差异亲和作用的差异亲和层析法亲和层析法/亲和电泳法亲和电泳法免疫吸附层析免疫吸附层析/亲和膜分离法亲和膜分离法共价层析法共价层析法/金属螯合层析法金属螯合层析法疏水作用的差异疏水作用的差异疏水作用层析法疏水作用层析法分配系数产差异分配系数产差异分配层析分配层析/双水相萃取双水相萃取/有机溶剂萃有机溶剂萃取取/超临界流体萃取超临界流体萃取对酶活性的初步探索对酶活性的初步探索在制定纯化方法时应考虑该酶以下几方面：分子量等电点稳定性（以pH、温度、变性剂、鳌合剂、巯基试剂等）动力学常数（对底物、抑制剂、激活剂、辅助因子）。

利用酶的稳定性利用酶的稳定性1.确定纯化过程中保持酶活性应维持的条件；2.若酶对极端温度、pH、有机溶剂或变性剂表现出不寻常的稳定性，则可利用这方面的性质，通过变性条件除去粗提液中大量的杂蛋白性质的精确数据pI、分子量、Km、Ki、Ka等应在获得纯酶后进一步测定以确认或校正结构特征分析结晶 X-晶体衍射技术 核磁共振 质谱 光谱基因分析制订酶的纯化程序制订酶的纯化程序建立一个最有效的酶纯化程序，应考虑以下原则：（1）利用酶在分离纯化上最有利的特性；（2）尽早使用一种选择性好的方法；（3）选择交换能力高的层析技术作为第一步层析；（4）不要连续使用相同的纯化方法，要使每步过程的分辨能力呈递增趋势；（5）将各层析步骤连接起来，使前一步得到的样品适用于下一步层析；（6）在造成酶被稀释的步骤后来要用浓缩酶的方法；（7）纯化过程中做三件事：量体积，测酶活力和测蛋白质浓度，监测纯化的进程7.2.2粗酶液的制备粗酶液的制备材料的选择材料的选择应具备酶含量丰富，材料易得，价廉等特点采用代谢诱导的方法来提高生物材料中酶的含量采用DNA重组技术得到酶含量丰富的工程菌株预处理预处理 动物或植物的器官组织、微生物作材料动物或植物的器官组织、微生物作材料 例如例如 动物材料要剔除结缔组织、脂肪组织；动物材料要剔除结缔组织、脂肪组织；油质种子最好先用乙醚等脱脂；油质种子最好先用乙醚等脱脂；种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染；种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染；微生物材料则应将菌体和发酵介质分离。

微生物材料则应将菌体和发酵介质分离材料须尽可能以非常新鲜的状态直接应用，材料须尽可能以非常新鲜的状态直接应用，否则就应将完整材料立即冰冻起来否则就应将完整材料立即冰冻起来破细胞破细胞酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况1.释放到细胞膜外的酶，叫胞外酶；2.游离化细胞内的酶，叫溶酶；3.牢固与膜或细胞颗粒结合在一起的，叫结酶后两者合称胞内酶细胞破碎的方法细胞破碎的方法机械破碎法机械破碎法物理破碎法物理破碎法化学破碎法化学破碎法酶促破碎法酶促破碎法酶的抽提酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称酶的提取7.2.3酶分离纯化过程的评价酶分离纯化过程的评价在酶的抽提和纯化过程中，为了了解所选择的方法和条件是否适宜，每一步骤前后都应进行酶的活力测定，作出总活力与比活力的比较酶的分离纯化过程中必须做三件事：酶的分离纯化过程中必须做三件事：1.测定酶活力（IU/mL）；2.测定蛋白质含量(mg/mL)；3.测量体积(mL)活力回收（亦称为回收率或产率）纯化倍数（亦称比活力提高倍数）y(回收率)=原料的总活力某步骤后的总活力e(纯度提高)=原料的比活力某步骤后的比活力100%100%纯化方法与条件的比较标准纯化方法与条件的比较标准计算公式在酶的纯化过程中，将各个步骤的测定结果列成“分离纯化表”以便进行总结、检查和改进。

番麻蛋白酶分离纯化表番麻蛋白酶分离纯化表步骤步骤总体积总体积/mL总蛋白总蛋白/mg总活力总活力/U比活力/U/mg纯化纯化倍数倍数产率产率/%1.抽抽提提11036564682.10177.302.硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀10145.547179.84324.401.8472.943.SephadexG506523.338810.341665.689.4060.004.spSephadexC504011.436563.453207.3218.1056.535.结结晶晶6.2829642.344346.3424.5045.83步步骤骤比活比活/(U/mg)/(U/mg)产产率率/%/%总总酶酶活活/U/U纯纯化倍数化倍数粗粗酶酶30301001001431431 1苯基苯基琼琼脂糖脂糖6464515170702 2辛基辛基琼琼脂糖脂糖8686232336363 3MonoQMonoQ211211171724247 72,52,5ADPSepharoseADPSepharose3063069.69.614141010L.brevis的醇脱氢酶分离纯化表总总酶酶活活/U/U总总蛋白蛋白/mg/mg比活比活/(/(Umg Umg-1-1)纯纯化倍数化倍数产产率率/%/%细细胞提取胞提取1176011760177417740.1480.1481 1100100(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4分离分离43284328179417940.410.412.72.736.836.8DEAEDEAE琼琼脂糖脂糖14781478140814080.950.956.46.412.612.6琼琼脂糖脂糖1212284284104110413.663.6624.724.72.42.4苯基苯基琼琼脂糖脂糖1931938088084.184.1828.228.21.61.6Thermoanaerobium菌株JW/SL-YS489的木糖异构酶的纯化表纯度的鉴定 纯度提高和回收率的鉴定能帮助我们选择纯化方法与纯化条件。

但是经过一定的纯化步骤后，为了了解所获得的样品是否均一纯净还要进行纯度鉴定酶均一纯净性的鉴定有以下几种方法:（1)溶解度法 （2）电泳法 （3）超离心法 （4）免疫学法7.4酶的剂型与保存酶的剂型与保存为适应各种。