雪灵芝提取物总黄酮测定及对小鼠的镇痛作用.doc

1雪灵芝提取物总黄酮测定及对小鼠的镇痛作用作者：龚受基,姜翠霞, 李腾飞,周以智, 段小群，徐庆【摘要 】 　　目的用分光光度法对雪灵芝提取物总黄酮含量进行了测定,探讨雪灵芝有效部位对小鼠疼痛的镇痛作用方法采用Na(NO2)2-AlCl3 法测定雪灵芝有效部位总黄酮含量；用热板法、醋酸致痛法观察药物对致痛小鼠反应的影响结果 C012 部位总黄酮含量为 59.16%，C013 部位总黄酮含量为 56.86%；C012 和C013 两部位对热板法致痛具有较好的镇痛作用，C012 部位 200 mg/kg 剂量镇痛效果显著，其 0.5 h 和 2.0 h P<0.001，4.0 h P<0.01，1.0 h P<0.05；100 mg/kg 在 0.5 h 有很好的镇痛效果（P<0.01） ；C013 部位 200 mg/kg 在 2.0,4.0 h 镇痛效果好（P 分别为 0.001 和 0.01） ，在 0.5 h P<0.05；剂量 100 mg/kg在 4.0 h 具有较好的镇痛效果（P<0.05） C012 部位对醋酸致痛在 100 mg/kg 剂量时具有很好的镇痛效果（P<0.01） ，50 mg /kg 具有较好的镇痛作用（P<0.05 ） 。

结论雪灵芝 C012 和 C013两部位总黄酮含量较高，具有显著的镇痛作用，其作用机制有外周和中枢参与 【关键词】 雪灵芝； 镇痛； 机制2雪灵芝系石竹科蚤缀属植物(Arenaria. spp)，多年生垫状草本，分布于青藏高原海拔约 5000 m 左右的永久雪线附近地带 《藏药志》记述雪灵芝性味功用“苦寒，清肺中之热，止咳，降血压，滋补；治肺炎、淋病、淋巴结核、子宫病” 彭宝珠等［1～3］对雪灵芝的药理药效学进行了研究试验证明，雪灵芝提取物有抗炎、抗免疫、解热镇痛、镇咳祛痰、抗乌头碱引起的心律失常作用、抗缺氧和降血压作用,对酒精性肝损伤具有明显的保护作用，并能够增强免疫功能，对肿瘤具有抑制作用雪灵芝是一种能提高综合免疫能力的传统药物，其药用价值有进一步研究的必要研究表明［4］ ，蚤缀中含有氨基酸、糖类、生物碱、黄酮苷、皂苷及香豆素等多种成分本研究对雪灵芝的提取物进行了分离，得到了镇痛有效部位，利用分光光度法对两个部位进行了总黄酮含量的测定,并其镇痛作用进行了研究1 材料1.1 药物与试剂阿司匹林，罗痛定注射液(广东省博罗先锋药业集团有限公司,批号:070904)，罗痛定片(成都市湔江制药厂,070603)；芦丁对照品（南京替斯艾么中药技术研究所，批号：3TCM027-080118） ；亚硝酸钠、氯化铝、乙醇、冰醋酸、氢氧化钠均为普通市售分析纯试剂；雪灵芝采自西藏自治区。

1.2 动物昆明种小鼠，雌雄不论，体质量 18～22 g，洁净级，由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：2005A033 号2 方法2.1 分光光度法测定总黄酮含量［5］雪灵芝药材采自西藏自治区，经广西植物研究所高级工程师黄定中鉴定为雪灵芝 Arenaria kansuensis Maxim雪灵芝全草用水提取，水提液上 D101 大孔树脂，以蒸馏水洗脱至无色；以 30%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得 C012；60%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得C013精确称取 20.0 mg 芦丁对照品，以 60%乙醇溶液超声溶解并定容至 100 ml，分别移取上述芦丁储备液0，1.00，2.00，4.00 ，6.00，8.00，10.00 ml 于 7 个 25 ml 量瓶中，加入 0.50 mol/L 的亚硝酸钠溶液 1.0 ml，摇匀静置 5 min 后，加入 0.30 mol/L 氯化铝溶液 1.00 ml，摇匀静置 5 min 后，加入1.00 mol/L 氢氧化钠溶液 5.0 ml，用 60%乙醇水溶液定容至刻度4取芦丁溶液在波长 360～600 nm 区间扫描，确定最大吸收波长为505 nm。

取不同浓度芦丁溶液于波长 505 nm 处比色测定吸光值，试剂空白参比，绘制标准曲线，线性回归分析得标准回归方程：A=2.353 5C-0.0371 2，回归系数 r=0.993 3分别精密称取样品 C012：0.300 5 g，样品 C013：0.300 9 g，用 60%乙醇溶解并定容到 50 ml 的容量瓶中，再各取两样品溶液 2 ml 于 50 ml 的容量瓶中，定容参照上述方法，吸取标准品溶液或样品溶液，进行精密度、稳定性、重现性和回收率实验［6］ 2.2 镇痛实验方法［ 7］2.2.1 热板法雌性小鼠，放在(55±0.5)℃ 的金属热板上，挑选痛阈值在5～30 s 的小鼠，根据痛阈值随机分生理盐水组、阳性药物组和测试药物高、中、低剂量组，每组 10 只，各组均 ig 给药（0.2 ml/10 g） ，1 次/d ，连续 7 d末次给药后不同时间分别再测痛阈,以药后痛阈的提高值为指标，进行组间比较2.2.2 对醋酸引起的小鼠扭体镇痛实验取昆明种小鼠 80 只，5随机分成 8 组，即生理盐水组，阿司匹林组（200 mg/kg） ，C012高、中、低剂量组（200，100 ，50 mg/kg） ，C013 高、中、低剂量组（200，100 ，50 mg/kg） ，每组 10 只。

连续灌胃给药 7 d，2 次/d，每次 0.2 ml/10g最后一次灌胃后 1 h，给各组小鼠腹腔注射 0.5%乙酸溶液 0.2 ml/只然后以腹部内陷、四肢伸展及臀部抬高为疼痛反应指标，观察 15 min 内出现扭体反应的次数，计算镇痛率镇痛率（% ）=［ (模型组扭体次数- 给药组扭体次数)／模型组扭体次数］×100％药效学实验数据以±s 表示，采用 SPSS 统计软件进行统计学处理3 结果3.1 精密度准确吸取标准品溶液 1 ml，分别置于 5 只 10 ml容量瓶中，按照标准曲线项下操作，测定吸光度，计算 RSD 为0.25%，精密度良好3.2 稳定性准确吸取标准品溶液 1 ml 置丁 10 ml 容量瓶中，按照标准曲线项下操作，测定 10，20，30，40 ，50 min 时吸光度，求得 RSD 为 1.58%，稳定性良好3.3 重复性取样品 C012 溶液 5 份，在操作条件下测定各自的总黄酮含量，求得 RSD 为 0.71%，重复性良好63.4 加入回收率实验量取样品溶液 3 份，加入不同量的芦丁对照品溶液，按实验方法进行显色，测定吸光度，计算回收率，回收率在 96%～101%之间。

3.5 总黄酮含量吸取 C012 和 C013 溶液，按标准曲线项下操作测定吸光值，计算总黄酮含量结果见表 1表 1 样品总黄酮含量测定结果(略)3.6 热板法实验结果见表 2，结果表明，雪灵芝化合物C012、C013 均对热板引起的疼痛有很好的抑制作用C012 部位200 mg/kg 镇痛效果显著，其 0.5 h 和 2.0 h，P<0.001；4.0 h， P<0.01；1.0 h，P<0.05 ，对疼痛的抑制作用时间较长；100 mg/kg 在 0.5 h 也有很好的镇痛效果（P<0.01） C013 部位 200 mg/kg 在 2.0,4.0 h 镇痛效果好（P<0.01 或 P<0.001） ；在 0.5 h， P<0.05；剂量 100 mg/kg 在 4.0 h 具有较好的镇痛效果（P<0.05） 表 2 雪灵芝提取物热板法镇痛结果 (略)3.7 扭体法实验结果见表 3由表 3 可见，C012 部位 100 mg /kg 具有很好的镇痛效果（P<0.01） ，50 mg /kg 具有较好的镇痛作用（P<0.05 ） ，但是高剂量组对醋酸引起的疼痛没有抑制作用表 3 雪灵芝提取物扭体法镇痛结果(略)74 讨论NaNO2-A1(N03)3 法源于芦丁含量测定法,并逐步用于黄酮类化合物的测定。

后来发现这并不是黄酮类化合物的专属反应,因为凡具有邻苯二羟基的物质均能用此法进行显色测量［8］ 多酚类物质具有邻苯二羟基结构，显色反应后在 504 nm 有很强吸收，会对黄酮的测定造成干扰，测定结果偏高AlC13 法测定时，芦丁、桑色素等黄酮类物质反应强烈，而对酚酸类、原花色素的反应很小［9］ ，该法对黄酮类化合物的专属性较强，因此，本实验确定选用 AlCl3法对雪灵芝提取物中的总黄酮进行定量测定药物治疗是缓解疼痛的主要措施之一，根据药物作用部位的不同，将镇痛药分为外周性镇痛药和中枢性镇痛药热板法利用小鼠爪趾对热刺激非常敏感的特性，考察中枢性镇痛药的镇痛作用，小鼠主要表现为跳跃、缩足、舔足；扭体法将刺激剂注入小鼠腹腔，引起炎性介质前列腺素的释放，诱导产生疼痛，常用作外周镇痛药的筛选我们分别用热板法和扭体法对从雪灵芝水提物分离得到的C012 和 C013 两个部位进行了比较研究C012 和 C013 两个部位对热板产生的小鼠足趾疼痛都有很好的防护作用，能够提高药后痛阈值，且作用时间较长C012 中剂量和低剂量对醋酸致痛具有较好的镇痛作用，高剂量则没有镇痛作用；8C013 各个剂量则没有作用。

C012 成分具有中枢镇痛作用，对快痛、化学刺激引起的持续性疼痛都有很好的镇痛作用，其具体作用机理和作用方式有待进一步研究镇痛有效部位总黄酮含量较高，可以认为镇痛的有效成分是总黄酮，具体黄酮成分有待进一步研究参考文献】［1］彭宝珠,冯伟力, 王利彦,等.藏药雪灵芝对炎症和免疫功能的影响［J］.中国中药杂志,1991,16(6):363.［2］赵 鹏，李 彬，姚思宇.等.雪灵芝对酒精性肝损伤保护作用的实验研究］.中华中西医杂志，2004, 5(17):1901.［3］李凤文, 赵 鹏,刘荣珍,等. 雪灵芝调节小鼠免疫功能作用的实验研究［J］.中国热带医学，2007,7(11):1999.［4］曹熙德. 雪灵芝开发研究［ J］.中国肿瘤,2001,10(4)：227.［5］毛跟年，许牡丹. 功能食品生理特性与检测技术［M ］.北京: 化学工业出版社，2004.［6］王光亚. 保健食品功效成分检测方法［M ］.北京:中国轻9工业出版社,2002.［7］徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学,第 3 版［M］.北京：人民卫生出版社，2002 ：882.［8］卢艳花. 中药有效成分提取分离技术［M ］.北京：化学工业出版社,2005:94.［9］徐宝才, 丁霄霖 .荞麦黄酮的测定方法［ J］.无锡轻工大学学报，2003，22 （ 2）：98.。