细胞工程复习精简版.doc

名词解释1.细胞工程：是指主要以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术2.愈伤组织：脱分化后的植物细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团，称之为愈伤组织（Callus）3.外植体：主要指用于离体培养的植物或组织切段4.极性（植物细胞）：细胞分化早期的一个最主要现象就是极性的建立，它使细胞的一端与另一端之间显示出结构和生理化上的差别，细胞内极性的建立是细胞分化开始的第一步5.动物细胞培养：是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术6.干细胞：干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞7.动物克隆：动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆8.前体：指某一代谢中间体的前一阶段的物质9.细胞融合：是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术10.单克隆抗体：经过免疫哺乳类动物单一的B淋巴细胞，可以分泌单一性抗体，这种具有特异性的、同性质的抗体为单克隆抗体。

11.组织工程；是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术12.动物克隆；重复同7，另克隆动物一般指采用核移植、胚胎移植技术得到的动物13.细胞转化：是指细胞发生遗传改变而产生永生化，即由限定性细胞系转化为连续性细胞系，可以在体外进行无限传代和生长繁殖14.胚胎干细胞：简称ES(Embryo Stem)细胞，是一种全能干细胞，它是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞15.动物细胞大规模培养：是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等）高密度大量增殖的技术培养流程：组织——消化——原代培养——传代培养（细胞系与细胞株）——小规模培养（转瓶等）——大规模培养（生物反应器）——产品16.看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖这块愈伤组织被称为看护组织具体方法：将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养优点是：简便、成功率高缺点是不能在显微镜下直接观察17.微载体：是直径60-250μm的适用于贴壁依赖型细胞生长的微粒一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。

18.获能：精子获能是指精子获得穿透卵子透明带能力的过程19.体细胞杂交：将两个亲本不同的体细胞的原生质体经人工诱导融合并培养再生成体的过程20.多倍体：是指个体细胞中含有超过正常数目染色体的个体二.简答题. 1.动物细胞大规模培养定义及有哪些培养系统？动物细胞大规模培养（cell largescale culture）：是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等）高密度大量增殖的技术培养系统：转瓶（管）培养、微载体培养，中空纤维生物反应器等2.单克隆抗体的技术流程?（1）动物免疫与免疫脾细胞制备；（2）骨髓瘤细胞的获得与培养；（3）细胞融合；（4）融合细胞的筛选；（5）克隆化培养；（6）分泌抗体的融合细胞的筛选；（7）单克隆抗体的大量生产3.举例说明动物细胞培养在生物制药中的应用1.病毒疫苗：灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、基因缺失的减毒活疫苗、基因工程亚单位疫苗2.干扰素：人白细胞干扰素IFN-α制备、成纤维细胞干扰素IFN-β制备、类淋巴细胞干扰素制备3.单克隆抗体4.胚胎干细胞应用中存在哪些问题?（1）来源限制：人类胚胎干细胞研究存在细胞来源限制问题2）体外培养困难：由于胚胎干细胞在体外培养会自发分化，而且机制还不非常清楚，控制胚胎干细胞分化的抑制的技术有待完善，例如饲养层细胞与条件培养基还不成熟。

3）安全性：胚胎干细胞和多能成体干细胞的自发分化方向是多向的，移植到体内的干细胞的分化方向会与预期不同干细胞移植后的成瘤性风险也比较大异体移植仍能引起免疫排斥反应4）伦理道德问题：获取人的胚胎干细胞、建立胚胎干细胞系必须要破坏胚囊，体外培养的胚囊是否具有生命还存在着争议，所以人类胚胎干细胞研究面临伦理道德问题5.试述细胞融合的方法、各方法的原理并分析其优缺点1）生物法：研究最早的细胞融合诱导方法主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合2）化学法：可以采用的化学诱导剂包括： NaNO3、高pH的高浓度Ca2+ 离子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明胶、抗体、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等，可能原理是细胞膜电荷平衡被打破PEG结合高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合方法成为一种较常用的细胞融合方法优点：基于PEG的诱导融合优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。

缺点：是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害3）物理法：最常用的电融合诱导法，在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭和成完整的膜形成融合体优点：融合率高、重复性与可控制性强缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤6.化学方法诱导细胞融合可以分为哪几类?（1）NaNO3诱导融合：NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷，引起原生质体聚集，促进细胞融合 NaNO3对原生质体无损害，但融合效率低，一般小于4%2）高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合：钙离子中和原生质体膜或细胞膜表明表面电荷，使彼此紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高pH能改变质膜的表面电荷，利于细胞融合3）PEG诱导：PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合4）高Ca2+和pH诱导PEG结合：诱导在高Ca2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调，从而提高融合的几率。

7.胚胎干细胞分化潜能评价？（1）体外分化实验：将获得的胚胎干细胞制成悬浮液培养在铺有明胶的培养皿中，一段时间后部分细胞贴壁生长，分化成神经、肌肉、软骨等不同细胞2）体内分化实验：将一定量的胚胎干细胞注射进同源动物皮下，有组织瘤生成3）嵌合体形成：将胚胎干细胞通过聚集法或者注射法与受体胚胎结合，并且将胚胎移植进同期化代孕母受体，各自表达自己的基因型，最终得到嵌合体动物4）核移植：以胚胎干细胞作为核供体移植到去核卵母细胞中，观察重组胚胎是否能正常发育、产生个体8.人工种子结构上从里到外分为哪几部分，分别是什么？结构上从外向里包括三部分：（1）人工种皮外层，保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部力量冲击；（2）人工胚乳 含有必需的营养成分和某些植物激素；（3）胚状体或芽9.影响植物细胞次级代谢产物的因素？（下面内容可以只答个大概）（1）生物因素：细胞株：稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培养生产代谢产物的前提；细胞凋亡：细胞凋亡是植物细胞培养过程中不可避免的现象，但是可以通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡；细胞团：细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持，同时造成了培养物的显著异质性，细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异。

此外，细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液粘度增加，致使气体交换与传递受到影响要保持反应器良好的混合效果适当大小的细胞团有利于代谢产物积累；生物合成机制：结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢途径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术2）化学因素：主要通过合适的培养基选择来控制，包括营养盐、前体和调节因子等营养盐：一方面是保证植物细胞生物量的增长；另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代谢产物；前体：指某一代谢中间体的前一阶段的物质缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物，如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代谢产物或使其产量增加诱导子：是指那些能够与细胞发生相互作用，通过细胞内一系列的信号转导过程，作用于与细胞次生代谢相关的基因表达，进而改变细胞次生代谢相关酶的活力，最终使细胞次生代谢水平发生改变的物质反馈抑制：植物次级代谢产物在培养系统的积累有时会对目标产物的合成具有反馈抑制可以采用流加/半连续培养、两相培养等工艺技术可以克服3）物理因素：主要包括：光照、温度、通气、搅拌、pH值等光照：光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响光照时间长短、光质、光强等都会对代谢产物合成和积聚产生作用。

光对许多酶有诱导或抑制作用温度：温度会影响酶的活性细胞的生长速率与培养温度紧密相关植物细胞培养一般在25℃左右进行pH：会影响培养液的渗透压、酸碱度，酶的活性，从而影响细胞代谢最佳的起始pH在5.5－5.8 之间如果对培养液pH进行控制，将有利于次级代谢产物的生成4）工程技术问题：培养液的流变特性：由于植物细胞培养过程中容易结团，同时，不少细胞在培养过程中容易分泌粘多糖等物质，从而使传氧速率降低，影响细胞生长气体传递：氧气和CO2的含量与传递对培养过程影响较大，氧的传递与通气速率、培养液混合程度、培养液流变特性、气液界面面积等因素有关；而氧的吸收与反应器类型、细胞生长速率、温度、pH、营养组成、细胞浓度等相关搅拌与剪切力：为了加强气－液－固之间的传质，细胞悬浮培养时需要混合搅动植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆弱，对搅拌的剪切力很敏感由于剪切力比较大，细胞会自溶，次级代谢产物合成会降低泡沫与器壁表面粘附性：植物细胞培养过程中产生气泡大，由于培养液含有蛋白质或粘多糖，粘度大，细胞很容易被包埋在泡沫里，造成非均相培养，也可从营养液中带出来，造成损失或污染因此，必须对泡沫进行消除提高次级代谢产物产量的途径：培养设备、培养工艺、培养技术。

10.详述核移植技术的一般操作程序？（1）核供体细胞获得与取核：供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞分离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进行1～5 天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态（一般进入G0 期）采用细胞松弛素B（Cytochalasin B）诱发细胞排核或者显微操作取核等方法得到细胞核2）受体细胞去核：用微细玻璃管吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质；用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色，在紫外观察下去核可提高去核成功率；使用Hoechst33342与卵细胞DNA结合后，用紫外线定点照射使核功能丧失3) 细胞核移植：细胞核移植可以采用胞质内注射和透明带下注射方法前者是用微吸管吸取供体核后，直接注射进卵子细胞质；后者是把细胞核注射进透明带和卵细胞间的卵周隙中4）激活：重组胚的发育需要进一步激活，可以采用电激活和化学激活方法前者是把重组胚放在电融合槽两极之间，用几次瞬时直流脉冲刺激使其激活后者常用的激活剂包括乙醇、SrCl2、放线菌酮、离子霉素等5) 重组胚培养和移植：激活后。