SDSPAGE原理步骤详细介绍含图片课件.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE第1页，共64页一、什么是SDS 十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)是一种阴离子去污剂它在水溶液中以单体（monomer）和分子团（micellae）的混合形式存在 第2页，共64页SDS的作用 破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物 第3页，共64页一、SDS-PAGE的基本原理（一）蛋白质分子的解聚（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于移率主要取决于亚基分子量的大小亚基分子量的大小，而电，而电荷因素可以被忽略荷因素可以被忽略 第4页，共64页1 1、SDSSDS 阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂 助溶性试剂助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构破坏蛋白质分子的二级和三级结构第5页，共64页。

2 2、强还原剂、强还原剂 巯基乙醇（巯基乙醇（-mercaptoethanal-mercaptoethanal）二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（dithiothreitoldithiothreitol，DTTDTT）使半胱氨酸残基之间的使半胱氨酸残基之间的二硫键二硫键断裂断裂 第6页，共64页第7页，共64页SDSSDS和还原剂的作用：和还原剂的作用：（1 1）分子被解聚分子被解聚或组成它们的多肽键或组成它们的多肽键（2 2）氨基酸侧链与）氨基酸侧链与SDSSDS充分结合充分结合形成形成带负带负 电荷的电荷的蛋白质蛋白质-SDSSDS胶束胶束 （3 3）蛋白质）蛋白质-SDSSDS胶束所带的负电荷大大超胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量，过了蛋白质分子原有的电荷量，消除消除 了不同分子之间原有的了不同分子之间原有的电荷差异电荷差异 第8页，共64页蛋白质蛋白质-SDSSDS胶束的特点胶束的特点（1 1）形状像一个长椭圆棒）形状像一个长椭圆棒（2 2）短轴对不同的蛋白质亚基）短轴对不同的蛋白质亚基-SDSSDS胶束基胶束基本上是相同的本上是相同的 （3 3）长轴的长度长轴的长度则与亚基分子量的大小则与亚基分子量的大小成正比成正比 第9页，共64页。

胶束在胶束在SDS-PAGESDS-PAGE系统中的电泳迁移系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要要取决于椭圆棒的长轴长度取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或，即蛋白质或亚基分子量的大小亚基分子量的大小当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在1515KDKD200KD200KD之之间时，间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系性关系第10页，共64页3 3、影响、影响SDSSDS电泳的关键因素电泳的关键因素（1 1）溶液中溶液中SDSSDS单体浓度单体浓度 大多数蛋白质与大多数蛋白质与SDSSDS结合的重量比为结合的重量比为1 1：1.41.4（2 2）样品缓冲液的离子强度样品缓冲液的离子强度 低离子强度低离子强度的溶液中，的溶液中，SDSSDS单体才具有单体才具有较高的平衡浓度较高的平衡浓度 第11页，共64页3 3）二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原 当二硫键被当二硫键被彻底还原彻底还原后，蛋白质分子后，蛋白质分子才能才能被解聚被解聚，SDSSDS才能定量地结合到亚才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。

线性关系第12页，共64页二）缓冲系统的选择（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的的pHpH范围，凡范围，凡不与不与SDSSDS发生相互作用发生相互作用的缓的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的白质的分离和电泳的速度是非常关键的 第13页，共64页电泳缓冲液的种类：电泳缓冲液的种类：1 1、磷酸缓冲液、磷酸缓冲液2 2、Tris-Tris-醋酸钠缓冲系统醋酸钠缓冲系统3 3、咪唑缓冲液系统：、咪唑缓冲液系统：比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍度要比后者快一倍 4 4、尿素系统：、尿素系统：适用分子量低于适用分子量低于1515KDKD的蛋白样品的蛋白样品 5 5、Tris-Tris-甘氨酸甘氨酸系统：系统：使用最多的缓冲液使用最多的缓冲液6 6、Tris-Tris-硼酸盐缓冲液：硼酸盐缓冲液：测定糖蛋白的分子量测定糖蛋白的分子量第14页，共64页三）凝胶浓度的选择（三）凝胶浓度的选择 由于由于SDSSDS电泳分离并不取决于蛋白质电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-SDS-蛋白质胶束的大小蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。

会直接影响分辨率不同分子量范围的蛋白质应选用不同分子量范围的蛋白质应选用不同不同的凝胶浓度的凝胶浓度 第15页，共64页第16页，共64页第17页，共64页第18页，共64页第19页，共64页四）分子量测定（四）分子量测定1 1、相对迁移率（、相对迁移率（RfRf）Rf Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的沿的迁移距离得到的测量位置应在蛋白带的中央测量位置应在蛋白带的中央蛋白带迁移距离蛋白带迁移距离Rf=Rf=溴酚蓝迁移距离溴酚蓝迁移距离第20页，共64页蛋白带迁移距离蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度固定前的凝胶长度 Rf=Rf=X X 干燥后的凝胶长度干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离溴酚蓝迁移距离第21页，共64页2 2、作图、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，RfRf为横坐标绘图为横坐标绘图第22页，共64页第23页，共64页3 3、通过测定未知蛋白质的、通过测定未知蛋白质的RfRf值，便可在标值，便可在标 准曲线上读出他的分子量准曲线上读出他的分子量第24页，共64页第25页，共64页。

二、去污剂的选择二、去污剂的选择无离子去污剂：无离子去污剂：Lubro WLubro W；Brij35Brij35，Tween Tween Triton Triton阳离子去污剂：阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium cetyltrimethyl ammonium bromide bromide（CTABCTAB）cetylpyyridinium cetylpyyridinium（CPCCPC）阴离子去污剂：阴离子去污剂：SDS deoxycholateSDS deoxycholate第26页，共64页三、方法三、方法1 1、分类、分类（1 1）根据对样品的处理方式的不同）根据对样品的处理方式的不同 还原还原SDSSDS电泳电泳 非还原非还原SDSSDS电泳电泳 带有烷基化作用的还原带有烷基化作用的还原SDSSDS电泳电泳第27页，共64页2 2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同 连续电泳连续电泳 不连续电泳不连续电泳（3 3）根据电泳的形式）根据电泳的形式 圆盘电泳圆盘电泳 垂直电泳垂直电泳 平板电泳平板电泳 水平电泳水平电泳第28页，共64页。

第29页，共64页第30页，共64页第31页，共64页2 2、操作、操作（1 1）制备分离胶制备分离胶（2 2）制备积层胶制备积层胶(堆积胶）堆积胶）第32页，共64页第33页，共64页第34页，共64页第35页，共64页第36页，共64页分离胶聚合之后分离胶聚合之后第37页，共64页第38页，共64页第39页，共64页第40页，共64页第41页，共64页第42页，共64页第43页，共64页第44页，共64页3 3）加样品加样品样品的处理样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的在蛋白溶液中加入过量的SDSSDS后，可引起以后，可引起以下的反应：下的反应：蛋白质蛋白质本身的电荷被屏蔽本身的电荷被屏蔽 氢键断裂氢键断裂 疏水相互作用被取消疏水相互作用被取消 多肽被去折叠多肽被去折叠(二级结构破坏二级结构破坏),),并形成椭球型并形成椭球型第45页，共64页还原还原SDSSDS处理处理 当加入还原试剂当加入还原试剂DTTDTT或或-二巯基乙醇后，蛋二巯基乙醇后，蛋白质被白质被完全去折叠完全去折叠，只根据分子量分离，只根据分子量分离 第46页，共64页带有烷基化作用的还原带有烷基化作用的还原SDSSDS处理处理 烷基化作用烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护可以很好地并经久牢固地保护SHSH基团，而得到窄的电泳带基团，而得到窄的电泳带 第47页，共64页。

非还原的非还原的SDSSDS处理处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，一般只许多样品，如生理体液、血清或尿素，一般只需用需用1%1%SDSSDS在在100100煮沸煮沸3 3分钟，并不需要加还原剂，分钟，并不需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠此时二硫键不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠 第48页，共64页4 4）电泳电泳（5 5）固定固定第49页，共64页6 6）染色染色考马斯亮蓝（考马斯亮蓝（coomassie brilliant coomassie brilliant blueblue）R-250 R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含有两个有两个SO3HSO3H基团，偏酸性，和氨基黑一样基团，偏酸性，和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上也是结合在蛋白质的碱性基团上 第50页，共64页第51页，共64页G-250G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色二甲花青亮蓝，蓝绿色第52页，共64页第53页，共64页银染色银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银银染的机制是将蛋白带上的硝酸银（银离子）（银离子）还原成金属银还原成金属银，以使银颗粒，以使银颗粒沉积在蛋白带上沉积在蛋白带上 第54页，共64页。

第55页，共64页7 7）照相，凝胶干燥照相，凝胶干燥（8 8）定量测定定量测定第56页，共64页3 3、电泳过程中的不正常现象、电泳过程中的不正常现象（1 1）“微笑微笑”现象现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的说明凝胶的不均匀冷却不均匀冷却，中间部分冷却，中间部分冷却不好不好 第57页，共64页2 2）“皱眉皱眉”现象现象 由于垂直电泳槽的由于垂直电泳槽的装置不合适装置不合适引起的，引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全全 第58页，共64页第59页，共64页3 3）“拖尾拖尾”现象现象 样品溶解不佳样品溶解不佳引起第60页，共64页4 4）“纹理纹理”现象现象由于样品中的由于样品中的不溶颗粒不溶颗粒引起的第61页，共64页5 5）偏斜现象）偏斜现象 电极放置不平行电极放置不平行引起或引起或加样位置偏斜加样位置偏斜而引起而引起第62页，共64页6 6）带太宽）带太宽 加样加样量太多量太多或加样或加样孔泄漏孔泄漏引起引起第63页，共64页。