水稻锌指蛋白基因CRISPR-Cas9突变体的构建及突变分析.docx

    水稻锌指蛋白基因CRISPR/Cas9突变体的构建及突变分析    易勇　郑瑞　杨波　栾维江　郭嗣斌　沙爱华摘要：【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻锌指蛋白基因（OsC3H54）进行基因编辑，筛选鉴定出其突变体植株，为深入研究OsC3H54的生物学功能提供良好材料，也为水稻锌指蛋白研究提供参考依据方法】通过E-CRISP在OsC3H54基因的外显子上设计靶点序列，将靶点序列连接至OsU6SK载体上，再与Cas9一起连接到pCAMBIA1300双元载体上，获得CRISPR/Cas9重组双元载体，通过农杆菌介导将其转入日本晴水稻愈伤组织，利用潮霉素进行抗性筛选，获得突变体植株，并分析其靶点位置的碱基及编码氨基酸突变情况结果】在OsC3H54基因第2个外显子上找到2个符合靶点设计要求的靶点，分别为TG1：5'-CCGCCGCGGCTGCCTTTGGATAC-3'和TG2：5'-CCTTCCC CAATGGCGGGGGTGGC-3'将OsU6SK载体和靶点序列正确连接的重組载体与Cas9一起连接至pCAMBIA1300双载体上，成功获得CRISPR/Cas9重组双元载体（pCAMBIA1300-Cas9-TG1和pCAMBIA1300-Cas9-TG2）。

通过农杆菌介导转入日本晴水稻，经潮霉素抗性筛选获得TG1靶点株系和TG2靶点株系，共16株CRISPR/Cas9突变体植株CRISPR/Cas9突变体植株在靶点序列的突变位点位置附近出现套峰，表明2个株系的植株均发生碱基突变，其中Y1、Y2、Y3和Y4突变体植株均为单碱基插入突变，最终导致编码的氨基酸发生移码突变，蛋白翻译提前终止结论】水稻OsC3H54基因CRISPR/Cas9突变体植株的获得为进一步研究水稻锌指蛋白生物学功能提供了良好材料关键词： 水稻;锌指蛋白;C3H54;CRISPR/Cas9;基因编辑;突变体植株;突变分析： S511.035.3                            文献标志码： A ：2095-1191（2020）11-2607-07CRISPR/Cas9 mutants construction of rice zinc finger protein gene and mutation analysisYI Yong1， ZHENG Rui2， YANG Bo2， LUAN Wei-jiang2， GUO Si-bin3， SHA Ai-hua1*（1College of Agriculture，Yangtze University/Hubei Collaborative Innovation Center for Industrialization of Major Grain Crops， Jingzhou， Hubei  434025， China; 2College of Life Science，Tianjin Normal University， Tianjin  300387， China;3Rice Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratoryof Rice Genetics and Breeding， Nanning  530007， China）Abstract：【Objective】The rice zinc finger protein gene（OsC3H54） was genetically edited based on CRISPR/Cas9 gene editing technology， and the mutant plants were screened and identified， which would provide materials for in-depth study of the biological functions of OsC3H54 as well as reference for the research of rice zinc finger protein. 【Method】The target sequence was designed on the exon of rice OsC3H54 gene through E-CRISP， and the target sequence was liga-ted to the OsU6SK vector to obtain the target link vector. Then the target link vector together with Cas9 were integrated to pCAMBIA1300 to obtain the CRISPR/Cas9 recombination binary vector， which was then transformed into Nipponbare rice callus  with Agrobacterium-mediated method. The positive transformed plants were screened out   using hygromycin， and the mutated bases at the target site and encoded amino acids were analyzed. 【Result】Two targets were found on the second exon of OsC3H54， which met the target design requirements， named TG1：5'-CCGCCGCGGCTGCCTTTGG ATAC-3' and TG2： 5'-CCTTCCCCAATGGCGGGGGTGGC-3'. The OsU6SK vector and recombinant vector with correct target sequence and the empty Cas9 vector were ligated to the pCAMBIA1300 binary vector， and the CRISPR/Cas9 recombinant binary vector（pCAMBIA1300-Cas9-TG1 and pCAMBIA1300-Cas9-TG2） was successfully obtained. The CRISPR/Cas9 recombinant vectors were transferred to Nipponbare based on Agrobacterium-mediated method with hygromycin resistance for transforms screening. A total of 16 CRISPR/Cas9 mutant lines of TG1 and TG2 target were obtained. A set of peaks near the mutation site of the target sequence in the CRISPR/Cas9 mutant lines were detected， indicating that base mutations happened in two transformed lines. Among them，the Y1，Y2，Y3 and Y4 mutant lines were all single-base insertions mutations that led to premature termination of amino acid traanslation with frameshift mutations. 【Conclusion】The obtained CRISPR/Cas9 mutant plant of OsC3H54 provides good materials for biological functions studying of rice zinc finger protein.Key words： rice; zinc finger protein; C3H54; CRISPR/Cas9; gene editing; mutant plants; mutation analysisFoundation item：National Key Research and Development Program of China （2018YFD0301301-5-2）; Guangxi Natural Science Foundation （2017GXNSFDA198039）; Guangxi Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding Open Pro-ject （No.160-380-16-1）0 引言【研究意义】水稻（Oryza sativa）是全球主要的粮食作物之一，世界上近一半人口以稻米为主食，其对我国农业的可持续发展也发挥着举足轻重的作用（刘凯等，2019）。

锌指蛋白是一类通过与Zn2+结合形成短且稳定、能自我折叠成“手指”形状结构域的蛋白，其结构域由3个半胱氨酸和1个组氨酸组成，在植物体内主要作为转录因子对基因表达发挥重要作用（刘丹等，2019）该蛋白家族拥有众多成员，主要调控植物生长发育C3H54是锌指蛋白家族的成员之一，克隆其编码基因并构建基因编辑突变植株，对研究锌指蛋白在水稻生长发育过程中的调控作用具有重要意义前人研究进展】锌指蛋白最早在非洲爪蟾中发现（Miller et al.，1985）根据锌指结构功能及序列的不同，可将锌指蛋白分成9种类型：C2H2、C2HC、C2HC5、C3H、C3HC4、C4、C4HC3、C6和C8（Berg and Shi，1996），其中C3H型锌指蛋白的研究较少（刘小艳等，2015）目前已有较多关于水稻锌指蛋白的研究报道：OsDOS是第一个在水稻中发现的锌指蛋白基因，其在水稻植株中过表达可延缓叶片衰老（Kong et al.，2006）;通过水稻全基因组分析共发现67个C3H基因，通过构建系统发育进化树可将其分为8个亚家族（Wang et al.，2008a）;水稻OsLIC基因能负调控油菜素内酯合成，其过表达会影响植株的形态建成（Wang et al.，2008b）;C3H12基因编码的锌指蛋白是一种核酸结合蛋白，可通过茉莉酸途径正向调节水稻白叶枯病抗性（Deng et al.，2012）;水稻OsTZF1基因过表达不仅可延缓水稻叶片衰老，还能阻滞水稻种子的萌发和生长（Jan et al.，2013）;水稻Ehd4基因编码一种新型锌指蛋白，可调控植株光周期，进而影响开花，可导致长日照条件下植株不开花，短日照条件下植株可提前开花（Gao et al.，2013）;水稻锌指蛋白基因OsZFP1在水稻中过量表达可提高植株稻瘟病抗性（李贺等，2015）;非典型的串联锌指蛋白IIP4不仅能与促进水稻次生壁生成的NAC29/NAC31上游调节因子相互作用抑制下游调节因子，从而抑制次生壁的形成， 还可调控植株的机械强度（Zhang et al.，2018a）。

此外，目前已有较多其他植物锌指蛋白的研究报道：橡胶树HbCZF1是一种非典型且具有C-X7-C-X5-C3-HCCCH基序和RNA识别基序的锌指蛋白，高度表达可激活hmg1基因的转录，参与天然橡胶的生物合成（Guo et al.，2015）;拟南芥AtTZF5通过TZF基。