微生物实操(精品).doc

实操四 甲基红(MR)试验和乙酰甲基甲醇试验(V～P试验)一、甲基红(MR)试验1．实验目的 (1)了解甲基红试验的反应原理和用途 (2)学习甲基红试验的操作技术2．原理多数细菌能分解葡萄糖，但分解葡萄糖的途径和产物不完全相同例如大肠杆菌和产气肠杆菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，若继续代谢还能生成其它有机酸和醛、醇等化合物其中，大肠杆菌所产生的酸能使培养液的pH降到4.2或更低，可使甲基红指示剂变成红色，并至少持续4d之久因此，甲基红试验是测定细菌利用葡萄糖产酸能力的强弱但这些微生物可将产生的酸进一步代谢，在4d或更长时间内生成中性化合物，不具有使甲基红变红的能力因此进行这项试验时，观察时间显得很重要肠道杆菌生长在37℃以下4d观察为宜，其它细菌也可参照同样时间3．实验材料 (1)菌种 大肠杆菌(Escherichia coli)和产气杆菌（Enterobacter aerogenes) (2)培养基 缓冲葡萄糖蛋白胨水(附录Ⅲ一9) (3)其它 酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等 (4)试剂 甲基红试剂(附录Ⅲ一46)4．方法与步骤取缓冲葡萄糖蛋白胨水培养基试管三支，于其上分别做好培养基名称和试验菌种、空白样等标记，然后无菌操作将实验菌种接入相应的试管中，连同空白对照置36℃±1℃恒温箱中培养2～4d后进行观察和记录结果。

5．结果与讨论在试验试管及空白管中各加入甲基红试剂5～6滴，呈鲜红色者为甲基红试剂阳性，呈橘红色者为弱阳性，呈橘黄色者为阴性二、乙酰甲基甲醇试验(V～P试验) 1．实验目的 (1)了解V—P试验的反应原理及用途 (2)学习V—P试验的操作技术2．原理和MR试验一样，V—P试验也是检验微生物利用葡萄糖产酸的能力产气肠杆菌利用葡萄糖产生丙酮酸后，可进一步使一部分丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇在强碱环境中，能被空气中的氧气氧化，生成双乙酰，双乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用生成红色化合物此即为V—P试验阳性当在试管中加入萘酚时，可如果某细菌在4d期间MR和v—P反应均为阳性，可延长培养时间，以确定生成的酸是否能转化成乙酰甲基甲醇对于一些发酵迟缓的微生物可能实验结果均为阴性，也应延长培养时间，以判断微生物是否能利用葡萄糖产生大量酸对于一种微生物，MR试验阳性，V-P反应一定阴性，反之亦然3．实验材料(1)菌种大肠杆菌(Escherichia coli)和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)2)培养基缓冲葡萄糖蛋白胨水培养基(附录Ⅲ～9)3)其它酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等。

4)试剂6％萘酚酒精溶液，40％氢氧化钾溶液4．方法与步骤 同MR试验5．结果与讨论在上述三支试管中分别按培养液一半的量加入6％萘酚酒精液，摇匀，再按培养液1／3的量加入40%氢氧化钾溶液，充分摇匀，观察结果，呈现红色者为V～P试验阳性，记做“+”号；不呈现红色者，为阴性，记做“一”号但后者应放在36℃±1℃下培养4h再进行观察判定实操五 吲哚试验和石蕊牛奶试验一、产生吲哚试验1．实验目的(1)了解吲哚试验的反应原理和用途2)学习吲哚试验的操作技术2．原理某些细菌具有色氨酸水解酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但加入对二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与吲哚作用，可生成红色的玫瑰吲哚其反应如下：3．实验材料(1)菌种大肠杆菌，(Escherichia∞li)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes).(2)培养基蛋白胨水培养基(见附录Ⅲ～lO)3)其它酒精棉球，酒精灯，接种环，洗耳球，lmL吸管及恒温箱等4)试剂 吲哚试剂 有两种：柯凡克氏试剂(附录Ⅲ一47)、欧一波试剂(附录III一48)4．方法与步骤 将测试菌接种于蛋白胨水培养基中，37℃培养l～2d，必要时可培养4～5d，观察结果。

5、结果与讨论 取培养好的试管，加入约0.5mL乙醚，振摇均匀后，静置分层，再沿管壁加入约1.5mL的吲哚试剂阳性者，在上层的乙醚层呈玫瑰红色，否则为阴性二、石蕊牛奶试验1．实验目的 (1)了解石蕊牛奶试验的反应原理及用途 (2)学习石蕊试验的操作技术2．原理 牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色还原时，则随还原程度的大小，部分或全部脱色 细菌对牛奶的作用有以下几种情况： ①产酸：细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红 ②产碱：细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝 ③胨化：细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比较澄清 ④酸凝固：细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红，当酸度很高时，可使牛奶凝固 ⑤凝乳酶凝固：有些细菌能产生凝乳酶使牛奶中的酪蛋白凝固，此时石蕊呈蓝色或不变色 ⑥还原：细菌生长旺盛时使培养基氧化还原电位降低，因而石蕊褪色 3．实验材料 (1)菌种大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌（Salmonella sp.) (2)培养基石蕊牛奶培养基试管(附录Ⅲ一11)。

(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等 4．方法与步骤 按从固体斜面到液体培养基中的接种方式接种待测菌株，空白对照和待测菌株试管于37℃恒温培养2～3d后观察结果，但切记观察时不要摇动试管 5．结果与讨论 试验结果以表格方式报告观察时，应注意以下情况： (1)牛奶的pH为6.7左右，石蕊在牛奶中由于牛奶的影响不呈蓝色而近于紫色，且随时间的延长而下沉，使用前要摇匀 (2)接菌培养产酸时，一般不呈红色，是因石蕊被还原牛奶培养基的浅紫色消退，培养时间长了，石蕊接触空气又被氧化，表面出现浅红色 (3)该试验连续观察很重要，因为产酸、凝固、胨化各现象是连续出现的，往往是在清楚地看到某种现象时，另一现象已经消失实操六 β-半乳糖苷酶试验和酪蛋白分解试验一、β-半乳糖苷酶试验1、实验目的 (1)了解β-半乳糖苷酶试验的用途与原理 (2)学习β-半乳糖苷酶试验的操作技术2、原理 在邻硝基酚β-D-半乳糖苷培养基（ONPG培养基）中含有邻硝基酚β-D-半乳糖苷和PH7.5的0.01mol／L的磷酸缓冲液当试验菌产生β-半乳糖苷酶时，邻硝基酚β-D-半乳糖苷被水解，释放出邻硝基酚，此物为酸碱指示剂，它的指示范围是6.8(无色)一8.6(黄色)，故能使pH7.5的培养液成为黄色，否则不变色。

3、实验材料 (1)菌种: 大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草杆菌 (2)培养基ONPG培养基(附录Ⅲ一4) (3)其它酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等4、方法与步骤 取ONPG培养基试管三支，于其上分别做好培养基名称和“大肠杆菌”、“爱德华氏菌”、“空白对照”等标记，然后分别将试验菌相应地接入ONPG培养基中，连同对照，置36℃±1℃培养1～3h和24h，观察结果5、实验结果 试管中培养基颜色变黄者为该试验阳性，记“+”号，否则记“一”号二、酪蛋白分解试验一、实验目的 (1)了解酪蛋白分解试验的用途及原理 (2)学习酪蛋白分解试验的操作技术二、原理 某些菌具有酪蛋白分解酶，而有的菌则不具有具有酪蛋白分解酶的细菌在酪蛋白琼脂平板上可以分解酪蛋白而使菌落周围形成透明圈三、实验材料(1)菌种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus）2)培养基酪蛋白琼脂培养基平板(附录Ⅲ一19)3)其它酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等四、方法与步骤以划线接种法将试验菌接种于酪蛋白琼脂培养基上，然后置37℃恒温箱培养1～2d后，五、实验结果平板中菌落周围有透明圈者，为酪蛋白分解试验阳性。

反之为阴性实操七 含碳化合物利用试验和淀粉水解试验一、含碳化合物的利用试验1、实验目的 学会测定某菌能否利用某一含碳化合物的方法2、原理 细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一碳源，反映该菌是否含有代谢这种含碳化合物有关的酶，因而可作为鉴定的依据做这项测定的基础培养基配方很多，因菌的种类而异培养基可制成液体分装试管，也可加1.5%～2%水洗琼脂制成平板可用来测定的底物种类很多，有单糖类、双糖类、糖醇类、脂肪酸类、羟基酸类、各种有机酸类、醇类、各种氨基酸类、胺类以及碳氢化合物等糖的含量一般为1%，醇类、酚等底物在培养基中含量一般为0.1%～0.2%，氨基酸的含量一般为0.5%因碳氢化合物不溶于水，可在液体中振荡培养或加入45℃左右的固体培养基中，用力振荡后立即倒成平板有些底物不宜加压灭菌，可用过滤法灭菌后加入无菌的基础培养基中，某些醇类和酚类则不需灭菌3、实验材料 (1)菌种大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis) (2)培养基细菌基础培养基(附录Ⅲ一5)试验时，往基础培养基中加糖类1%或醇、酚0.1%～0.2%，或氨基酸0.5%4、方法与步骤 将实验菌种首先制成悬液，以避免带入少量碳源而干扰实验结果。

平板接种用接种环点种，液体培养用直针接种每一测定菌都必须接种未加碳水化合物的空白基础培养基作对照适温培养2、5、7d后观察5、实验结果凡测定菌在有碳水化合物的培养基中的生长情况明显超过在空白基础培养基的生长量者为阳性，否则为阴性如两种培养基上生长情况差别不明显，可在同一培养基上连续移种三次，如差别仍不明显，则为阴性二、淀粉水解试验1、实验目的(1)了解淀粉水解试验的原理及用途2)学习淀粉水解试验的操作技术2、原理 许多细菌产生淀粉酶，能把培养基中的淀粉水解为无色糊精的等小分子，或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖淀粉水解后，遇碘不再变蓝色3、实验材料(1)菌种大肠杆菌(Escherichia coil)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2)培养基在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2％的可溶性淀粉，分装，0.1MPa20min灭菌3)试剂路哥氏碘液(附录I一3.2)4)其它酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等4、方法与步骤将培养基熔化，倒成平板，凝固后，取菌种点种于平板上，每皿可点3～5个菌，37~C培养2～4d，观察结果5、实验结果取培养好的平皿，在平板上滴加路哥氏碘液以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解，称淀粉水解试验阳性。

透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小实操八 细胞色素氧化酶试验和尿素酶试验一、细胞色素氧化酶试验1、实验目的(1)了解细胞色素氧化酶试验的用途与原理2)学习细胞色素氧化酶试验的操作技术2、原理在不以氧为直接受氢体的生物氧化体系中,生物氧化需要在多种酶联合作用下方能进行组成这类生物氧化体系的酶，主要是细胞色素类酶这种酶在有分子氧与脱氢酶的存在下，可氧化二甲基对苯撑二胺和α－萘酚成吲哚酚蓝，其反应式同氧化酶试验3、实验材料(1)菌种 大肠杆菌(Escherichia)和枯。