凯氏定氮法测定食品中蛋白质.ppt

课程名称课程名称 食品理化检测技术食品理化检测技术授课班级授课班级营养营养1431授课时间授课时间2016.4.152016.4.15授课时数授课时数2 2本次内容本次内容食品中蛋白质含量测定食品中蛋白质含量测定教具教具多媒体多媒体教学目标教学目标能力（技能）目标能力（技能）目标知识目标知识目标1.能能安安装装凯凯氏氏定定氮氮法法的的消消化化、、蒸蒸馏馏吸吸收收装置2.能能根根据据结结果果判判定定食食品标准1.了解蛋白质测定意义了解蛋白质测定意义2.掌掌握握常常量量凯凯氏氏定定氮氮法法测测定定蛋蛋白白质方法质方法3.了解试验中各种试剂作用了解试验中各种试剂作用重点重点蛋白质测定原理、步骤蛋白质测定原理、步骤难点难点蒸馏、吸收装置的安装蒸馏、吸收装置的安装能力训练方式方法能力训练方式方法讲解、问答、互动讲解、问答、互动教学环节时间安排教学环节时间安排复习：复习：5min；讲解、互动：；讲解、互动：75min小结：小结：5min；看书巩固知识点：；看书巩固知识点：5min课外任务课外任务对比微量和常量凯氏定对比微量和常量凯氏定氮法实验试剂、步骤的氮法实验试剂、步骤的区别区别课堂考勤课堂考勤4747参考资料参考资料《食品分析与检验技术》《食品分析与检验技术》《《食品理化检测技术食品理化检测技术》》2021/3/101凯氏定氮法凯氏定氮法测定食品中蛋白质测定食品中蛋白质2021/3/102一、概述一、概述 蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的含氮化合物，它是由含氮化合物，它是由20种氨基酸通过种氨基酸通过酰氨键酰氨键以以一定方式结合，并具有一定的空间结构。

一定方式结合，并具有一定的空间结构2021/3/1031生生命命的的物物质质基基础础3遗遗传传信信息息的的表表达方式达方式5人人及及动动物物需需要要从从食食品品得得到到蛋蛋白白质质及及其其分分解解产产物物，，来来构构成成自自身身的的蛋蛋白质白质2维维持持酸酸碱碱平平衡衡、、水平衡水平衡4维维持持物物质质的的代代谢及运转谢及运转6营养指标、营养指标、食品生产工艺食品生产工艺指标生理功能及在食品中的作用生理功能及在食品中的作用2021/3/104常见食物中蛋白质的含量常见食物中蛋白质的含量牛肉牛肉螺旋藻螺旋藻2021/3/105常见食物氮系数常见食物氮系数氮系数：蛋白氮系数：蛋白质含氮量的倒数，常用含氮量的倒数，常用6.25表示2021/3/106蛋白质测定方法蛋白质测定方法方法方法时间时间应用范围应用范围优缺点优缺点凯氏定氮法凯氏定氮法8-10h0.2-1.0mg氮时间长双缩脲法双缩脲法20-30min1-10mg氮灵敏度低、快速检测Folin－酚试－酚试剂法剂法40-60min<5mg氮灵敏度高、耗时长、试剂配制困难紫外吸收法紫外吸收法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法5-10min5-15min50-100mg蛋白质0～0.1mg/mL层析柱流出物检测较好，标准曲线有轻微非线性2021/3/107二、凯氏定氮法测定蛋白质（二、凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白粗蛋白））l 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。

1.1.原理原理1样品与浓硫酸和催样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其使蛋白质分解，其中中碳和氢被氧化为碳和氢被氧化为二氧化碳和水二氧化碳和水逸逸出出2样品中的样品中的有机氮有机氮转化为氨转化为氨与硫酸与硫酸结合成硫酸铵结合成硫酸铵3加碱蒸馏，使氨加碱蒸馏，使氨蒸出，用蒸出，用硼酸吸硼酸吸收收后再以标准后再以标准盐盐酸溶液滴定酸溶液滴定2021/3/108消化消化蒸馏蒸馏吸收、滴定吸收、滴定计算计算2.2.实验步骤实验步骤2021/3/109第一步：样品第一步：样品消化消化 样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水并破坏有机物，C、H氧化为二氧化碳、水逸出，蛋白质分解为氨、与硫酸结合生成硫酸铵、留在溶液中 对原子的前处理，使被测物质进入对原子的前处理，使被测物质进入溶液中，使不溶变为可溶、有机物分解溶液中，使不溶变为可溶、有机物分解为可溶性无机物为可溶性无机物消化消化2021/3/1010（（1 1）消化）消化总反应式：2NH2（（CH2））2COOH+13H2SO4 （（NH4））2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（98%））2021/3/1011消化装置消化装置“自动回流消化仪自动回流消化仪”2021/3/1012定氮消化的不同状态RCH2(NH2)COOH+H2SO4→CO2+H2O+SO2+ (NH4））2SO4澄清澄清消泡消泡碳化碳化2021/3/1013消化过程中试剂作用消化过程中试剂作用l硫酸钾硫酸钾：提高溶液沸点、加快反应进程；l硫酸铜（蓝绿色）硫酸铜（蓝绿色）：催化作用褐色褐色2021/3/1014(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O第二步第二步——蒸馏蒸馏2021/3/101501氢氧化钠需过量、若不够，会生成H2S,H2S是强酸，会使溶液颜色变红02防止样液中氨气逸出。

注意事项：2021/3/1016(3(3）吸收与滴定）吸收与滴定 吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸硼酸溶液 滴定：盐酸标准溶液， 硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂2021/3/1017各步骤操作细节图解：各步骤操作细节图解： 样品消化→蒸馏→滴定（（1）样品消化）样品消化样品+0.4g硫酸铜+6g硫酸钾+20ml浓硫酸+玻珠数粒先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟45度角消化终点瓶口不能对着人盖上小漏斗2021/3/1018（（2 2）蒸馏）蒸馏将消化液全部转移到100ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示剂2～3d加入NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色通入蒸汽开始蒸馏冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封2021/3/1019吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接收瓶，关闭电源2021/3/1020（（3 3）滴定）滴定 取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫酸标准溶液滴定至终点。

滴定前滴定终点同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积2021/3/1021实验注意事项实验注意事项—消化消化（（1）不时转动凯氏烧瓶、）不时转动凯氏烧瓶、缓和沸腾消化缓和沸腾消化（（2））消消化化至至呈呈透透明明后后，，继继续续消消化化30分分钟钟，，一一般般消消化化时间约时间约4小时小时（（3）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂（（4））样样品品不不易易澄澄清清时时可可冷冷却却后后加加入入30%过过氧氧化化氢氢2-3ml2021/3/1022小结小结2021/3/10232021/3/1024自动凯氏定氮仪法自动凯氏定氮仪法 在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点仪器：消化炉自动蒸馏装置2021/3/10251 1、、原理及适用范围原理及适用范围 2 2、、特点：特点： （（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热红外线加热的消化炉的消化炉 （（2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟分钟可可消化完毕。

消化完毕 （（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置可计算总氮百分含量并记录，自动数字显示装置可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成分钟完成1个样2021/3/1026双缩脲法（分光光度法）双缩脲法（分光光度法）1.1.原理原理————双缩脲反应双缩脲反应 碱性条件下、碱性条件下、双缩脲双缩脲与硫酸铜作用生成紫红色配与硫酸铜作用生成紫红色配合物的反应合物的反应 肽键（肽键（-CO-NH-）与双缩脲结构相似、能呈现此）与双缩脲结构相似、能呈现此反应反应 560nm处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少KOH、、CuSO4、酒、酒石酸钾钠配置石酸钾钠配置2021/3/1027标准曲线标准曲线l标准曲线（standard curve）是指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线R>0.999方可方可使用使用2021/3/10282.标准曲线绘制标准曲线绘制（1）配置一定浓度一定浓度（10mg/ml）的蛋白质标准溶液；（2）分别量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml蛋白质标准液于7支50ml比色管中；（3）向上述7支试管中分别加入1ml四氯化碳后、用碱性酒石酸铜溶液稀释至50ml，振摇、静止1h；（4）取上清液在2000r/min离心5min、560nm测定吸光度，绘制标准曲线。

最终测定溶最终测定溶液中不能有沉液中不能有沉淀淀2021/3/10293.3.样品测定样品测定样品含量需在40-100mg内4.4.结果计算（结果计算（mg/100gmg/100g））2021/3/1030燃烧法燃烧法2021/3/1031。