体内药物分析-生物样品与样品制备 (2).ppt

第三章 生物样品与样品制备药学院药物分析教研室1【大纲要求】1、掌握生物样品的种类及其特点2、掌握生物样品的各种预处理方法的原理及其应用2第一节第一节 生物样品的种类、采集生物样品的种类、采集 、制备与贮存、制备与贮存3一、种类、采集和制备( (一一) ) 血液血液( (Whole blood, Plasma, SerumWhole blood, Plasma, Serum) ) 1 1、血样采集、血样采集 2 2、血样制备、血样制备 血浆的制备血浆的制备 血液血液→→含有抗凝剂的试管含有抗凝剂的试管→→混合混合→ → 2500r2500r／／minmin ～～3000r3000r／／minmin离心离心5min →5min →上清液即为血浆上清液即为血浆 血清的制备血清的制备 血样血样→→室温放置室温放置30min30min到到1h →1h →出现血饼出现血饼→→剥去血剥去血 饼饼→→以以2000r/min2000r/min～～3000r/min3000r/min离心离心5min5min～～ 10min →10min →分取上清液即为分取上清液即为血清血清不能作为作用部位药物浓度的可靠指标当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品4肝素的加入：1ml血液/需要肝素0.1～0.2mg，通常不需准确加入，在取血前可取少量肝素钠溶液（1～2滴）置于试管内，旋转试管，使肝素溶液均匀分布于试管壁上，干燥后加入血样后立即轻轻振摇即可。

5全血：血液置于抗凝管中，不经离心操作，冷冻储存全血：血液置于抗凝管中，不经离心操作，冷冻储存 或直接分析或直接分析需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制血浆药物浓度很低凝影响测定血浆药物浓度很低凝影响测定血样的特点：血样的特点：缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦优点：可用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药优点：可用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药 物监测物监测大多数测定的时原型药物总量大多数测定的时原型药物总量6( (二二) ) 尿液尿液 1 1、尿药测定用途、尿药测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清：药物剂量回收研究、药物尿清 除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、 预测药物的代谢过程和代谢类型预测药物的代谢过程和代谢类型 2 2、尿的采集、尿的采集：非损伤性采样方式、药物浓度较高：非损伤性采样方式、药物浓度较高 、收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影、收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影 响。

响3 3、尿样的保存与处理、尿样的保存与处理：：7( (三三) )唾液唾液1 1、唾液的采集：漱口后、唾液的采集：漱口后15min15min进行，采集时间为进行，采集时间为10min10min，采用一些，采用一些 物理或化学方法刺激唾液分泌物理或化学方法刺激唾液分泌；；（（1 1）缩短采样时间，（）缩短采样时间，（2 2）减）减 小唾液小唾液pHpH变化范围，（变化范围，（3 3）刺激后得到的唾液其唾液－血浆分布）刺激后得到的唾液其唾液－血浆分布 比例的个体差异较小比例的个体差异较小2 2、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清 液冻存或直接分析液冻存或直接分析3 3、优点、优点：：（（1 1）非损伤性取样，（）非损伤性取样，（2 2）可用于药代动力学研究，（）可用于药代动力学研究，（ 3 3）不受采血时间和地点限制，（）不受采血时间和地点限制，（4 4）样品易收集，病人易接受）样品易收集，病人易接受4 4、应用：（、应用：（1 1））在在TDMTDM中的应用中的应用根据根据S/PS/P分类，分类，S/PS/P＜＜1.01.0表示药物在唾液中的浓度很低；表示药物在唾液中的浓度很低；S/PS/P＝＝1.01.0表示适合药物的监测；表示适合药物的监测；S/PS/P不固定不固定表示药物显著转移到表示药物显著转移到 了唾液中；了唾液中；S/PS/P很大很大表示药物的离子化程度很低表示药物的离子化程度很低（（2 2）药代动力学参数的测定）药代动力学参数的测定8组组 织织（（1 1）匀浆化法）匀浆化法：组织：组织→→加入水或缓冲液加入水或缓冲液→→匀浆匀浆→→上清液上清液（（2 2）沉淀蛋白法：组织）沉淀蛋白法：组织→→加入蛋白沉淀剂加入蛋白沉淀剂→→上清液上清液（（3 3）水解：组织）水解：组织→→加入酸或碱加入酸或碱→→加热使组织液化加热使组织液化→→上清上清 液液（（4 4）酶水解：组织）酶水解：组织→→加入酶和缓冲液加入酶和缓冲液→→加热使组织液化加热使组织液化 →→上清液上清液9头头 发发优点：优点：取样方便、无损伤性、检样的掺伪的可能性取样方便、无损伤性、检样的掺伪的可能性低、能对某些特定的代谢物进行测定、能了解数低、能对某些特定的代谢物进行测定、能了解数月至数年用药的情况、可用于体内微量元素含量月至数年用药的情况、可用于体内微量元素含量测定、可用于临床用药、滥用药物和毒性药物的测定、可用于临床用药、滥用药物和毒性药物的检测检测缺点：缺点：样品的预处理繁琐、干扰多、药物的含量低样品的预处理繁琐、干扰多、药物的含量低、需要精密仪器、需要精密仪器10特点：特点：广谱性广谱性积累性积累性稳定性稳定性依时性依时性相关性相关性指纹性指纹性一般在枕部采取样本，国外一般在靠近头皮处剪取，分别于6～10处取10个样本，从根部剪断，超过12cm的均按照12cm处剪断11头发洗涤头发洗涤1 1、丙酮－水－丙酮、丙酮－水－丙酮2 2、丙酮预洗、丙酮预洗→→洗洁精洗涤洗洁精洗涤3 3、洗衣粉浸泡、洗衣粉浸泡4 4、二氯甲烷、二氯甲烷5 5、、SDSSDS洗涤洗涤6 6、甲醇、甲醇头发的预洗头发的预洗都需要反复清 洗2～3次12毛发样品的制备毛发样品的制备1 1、直接甲醇提取、直接甲醇提取2 2、酸水解、酸水解3 3、碱水解、碱水解4 4、酶水解、酶水解5 5、超临界流体萃取、超临界流体萃取6 6、有机破坏、有机破坏13二、生物样品的贮存与处理（一）冷藏或冷冻（一）冷藏或冷冻1 1、血浆和血清：采血后及时分离（、血浆和血清：采血后及时分离（2h2h），短期），短期4℃4℃，长，长期期-20℃-20℃2 2、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存3 3、唾液：在、唾液：在4℃4℃下保存，往往需要在取样时测定下保存，往往需要在取样时测定pHpH值值4 4、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测完，不能反复完，不能反复冷冻冷冻→→解冻解冻→→冷冻冷冻(FTC)(FTC)；样品应以小；样品应以小体积分装存放。

体积分装存放14第二节 生物样品的预处理与制备15一、预处理目的（一）药物从缀合物中释放，测定总浓度（一）药物从缀合物中释放，测定总浓度（二）纯化、富集药物（二）纯化、富集药物（三）适应和满足测定方法要求的灵敏度（三）适应和满足测定方法要求的灵敏度（四）防止对分析仪器的污染和劣化（四）防止对分析仪器的污染和劣化16二、样品制备时应考虑的问题（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围 （二）药物测定的目的（二）药物测定的目的 （三）生物样品种类和杂质干扰类型（三）生物样品种类和杂质干扰类型 （四）样品的化学组成（四）样品的化学组成 （五）药物的蛋白结合率（五）药物的蛋白结合率 （六）被测组分在预处理过程中的稳定性（六）被测组分在预处理过程中的稳定性 （七）样品在收集、储存等过程中容器的污染（七）样品在收集、储存等过程中容器的污染 （八）样品的预处理过程要求简便（八）样品的预处理过程要求简便 （九）预处理的最后一步应富集被测组分（九）预处理的最后一步应富集被测组分 （十）对分析方法的要求（十）对分析方法的要求 1718三、样品的预处理技术（一）经有机破坏的方法（一）经有机破坏的方法 1 1、湿法破坏、湿法破坏 2 2、干法破坏、干法破坏 硝酸－高氯酸法硝酸－高氯酸法 高温电阻炉灰化法高温电阻炉灰化法 电热消化器法电热消化器法 低温等离子灰化法低温等离子灰化法 电热板消化法电热板消化法 烘箱消化法烘箱消化法 3 3、氧瓶燃烧法、氧瓶燃烧法19（二） 去除蛋白质1 1、溶剂解法、溶剂解法 常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）：常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）： 乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、 丙酮、四氢呋喃丙酮、四氢呋喃 体积比：体积比：1 1：：1 1～～3 903 90％去除％去除 方法：超速离心（方法：超速离心（10000r/min10000r/min））2021（二） 去除蛋白质2 2、加入中性盐、加入中性盐 常用中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白常用中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白 脱水而沉淀）：脱水而沉淀）： 饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸 橼酸盐橼酸盐 比例：比例：1 1：：2 902 90％去除％去除 方法：超速离心（方法：超速离心（10000r/min10000r/min））22（二） 去除蛋白质3 3、加入强酸、加入强酸常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）：常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）：1010％三氯醋酸、％三氯醋酸、6 6％高氯酸、硫酸－钨酸混合液％高氯酸、硫酸－钨酸混合液、、5 5％偏磷酸％偏磷酸体积比：体积比：1 1：：0.6 900.6 90％去除％去除方法：超速离心（方法：超速离心（10000r/min10000r/min））2324其他去除蛋白的一些方法其他去除蛋白的一些方法1 1、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂2 2、超滤法、超滤法3 3、酶水解法、酶水解法4 4、加热法、加热法25（三） 分离、纯化与浓集1 1、液－液提取法（、液－液提取法（LLELLE））2 2、固相萃取（、固相萃取（SPESPE））3 3、自动化、自动化SPESPE技术技术4 4、固相微萃取（、固相微萃取（SPMESPME））5 5、膜萃取（、膜萃取（MEME））6 6、微透析技术（、微透析技术（MDMD））7 7、超临界流体萃取（、超临界流体萃取（SFESFE）） 261 1、液－液提取法（、液－液提取法（LLELLE））大多数药物都是脂溶性的，内源性物质基本上都是水溶性的，当用有机溶剂萃取时，药物被萃取出来而内源性物质被除去，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化的目的。

27关键要考虑三个方面的因素：关键要考虑三个方面的因素：（（1 1）有机溶剂的特性）有机溶剂的特性（（2 2）有机溶剂相和水相的体积）有机溶剂相和水相的体积（（3 3）水相的）水相的pHpH值值28选择溶剂应注意的问题：选择溶剂应注意的问题：（（1 1）了解药物与溶剂的化学结构及性质，根据相似相溶来）了解药物与溶剂的化学结构及性质，根据相似相溶来 选择选择（（2 2）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶（（3 3）沸点低、易挥发和浓缩）沸点低、易挥发和浓缩（（4 4）要与水不相溶）要与水不相溶（（5 5）无毒、不易燃）无毒、不易燃（（6 6）不易乳化）不易乳化（（7 7）具有较高的化学稳定性和惰性）具有较高的化学稳定性和惰性（（8 8）不影响检测）不影响检测溶剂的选择与纯度要求溶剂的选择与纯度要求292 2、有机相和水相的体积：一般为、有机相和水相的体积：一般为1:11:1～～。