kle-单克隆抗体制备PPT.ppt

问题：问题：1、什么叫动物细胞融合？植物体杂交技术与动物细胞融合、什么叫动物细胞融合？植物体杂交技术与动物细胞融合有什么不同呢？有什么不同呢？2、动物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程、动物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？有什么影响？3、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？两者的融合过程是否也一样？？两者的融合过程是否也一样？动物细胞融合与单克隆抗体1、动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用动动物物细细胞胞融融合合动动物物细细胞胞融融合合细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法仙台仙台病毒病毒疱疹疱疹病毒病毒新城鸡瘟新城鸡瘟病毒病毒用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核细胞融合与融合诱导细胞融合物质：细胞融合与融合诱导细胞融合物质：诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇诱导细胞融合的仙台病毒必须诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活灭活。

思考讨论：思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？病毒需要灭活？不灭活行吗？        因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合        细胞融合技术应用于哪些方面？细胞融合技术应用于哪些方面？        细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体2、单克隆抗体什么是抗体？什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白疫功能的球蛋白B B淋巴细胞产生抗体淋巴细胞产生抗体抗体与相应抗原特异性结合抗体与相应抗原特异性结合B B淋巴细胞与抗体的关系淋巴细胞与抗体的关系：：１、１、B B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体２、动物体内的２、动物体内的B B淋巴细胞可以产生百万种以淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。

免疫作用３、每一个淋巴细胞只能产生一种抗体３、每一个淋巴细胞只能产生一种抗体所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？怎样解决这个问题？怎样解决这个问题？血清抗体（也称多克隆抗体）血清抗体（也称多克隆抗体） 由由血清血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多克隆多克隆抗体特点：特点： 产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏抗原不纯抗原不纯抗体不纯抗体不纯 抗原抗原 动物体内动物体内刺激刺激效应效应B B 抗体抗体 每一个每一个B B淋巴细胞只分泌一种淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，化学性质单一，特异性强的抗体特异性强的抗体 如果利用单个如果利用单个B B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆）淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学化学性质单一性质单一、、特异性强特异性强的抗体的抗体————单克隆抗体单克隆抗体。

问题：问题：      怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？在体外培养的条件下，一个在体外培养的条件下，一个B B淋巴细胞淋巴细胞能无限增殖形成细胞群吗？能无限增殖形成细胞群吗？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？？ ————肿瘤细胞！肿瘤细胞！科勒科勒米尔斯坦米尔斯坦荣荣获19841984年年诺贝尔生理学或医学生理学或医学奖 如果把一种如果把一种B B淋巴细胞与能在体外大量增殖的淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞融合细胞既能大量既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体增殖，又能产生足够数量的特定抗体 单克隆抗体单克隆抗体 　　　由单个　由单个B B淋巴细胞经过无性繁淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

隆抗体 特点：特点：特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 如何大量生产单克隆抗体？如何大量生产单克隆抗体？•利用淋巴细胞产生抗体的功能利用淋巴细胞产生抗体的功能•利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用肿瘤细胞无限增殖的特性•利用细胞融合的技术将利用细胞融合的技术将两种细胞融两种细胞融合合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的性的杂交瘤细胞杂交瘤细胞•利用动物细胞培养技术大量培养杂利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞交瘤细胞如何筛选？如何筛选？融融合合方方式式？？⑵⑵如何诱导融合？如何诱导融合？                                                                                       加入聚乙二醇加入聚乙二醇（（PEG））⑴⑴如何得到如何得到B B淋巴细胞？淋巴细胞？3.3.制备制备单克隆抗体的单克隆抗体的过程过程⑶⑶细胞两两融合后，有哪细胞两两融合后，有哪些类型？些类型？B-B B-B B-B-瘤瘤( (杂交瘤细胞杂交瘤细胞) ) 瘤瘤- -瘤瘤 ⑷⑷如何筛选出杂交瘤细胞？如何筛选出杂交瘤细胞？                                                                                                                          单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。

相同的     ①①首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞HAT是次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基细胞合成细胞合成DNA的原料的原料——脱氧核苷酸脱氧核苷酸的的合成具有两个途径：合成具有两个途径：1、、起始合成（起始合成（de novo pathway D途途径）径）2、补救（亦称替代或称中间）合成途、补救（亦称替代或称中间）合成途径，（径，（salvagepathway S途径）途径）即即用用“次黄嘌呤（次黄嘌呤（H））”和和“胸腺嘧啶胸腺嘧啶脱氧核苷（脱氧核苷（T））”为原料进行为原料进行补救合成补救合成     用用HGPRTHGPRT—型型瘤细胞，即缺乏瘤细胞，即缺乏次黄嘌呤次黄嘌呤-鸟鸟嘌呤嘌呤磷酸核糖转移酶（磷酸核糖转移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase））缺陷型缺陷型 变异株瘤细变异株瘤细胞（胞（本身本身无补救无补救合成途径合成途径无无S途径，途径， 只有起只有起始合成始合成途径途径有有D途径），与脾脏的途径），与脾脏的B细胞融合。

细胞融合瘤细胞瘤细胞本身本身无补救无补救合成途径（合成途径（Salvage pa-thway）（不能利用培养基中的）（不能利用培养基中的H 和和T ），只有），只有起始合成起始合成途径途径D途径合成途径合成DNA瘤细胞瘤细胞无无氨基喋呤时）只能利用氨基喋呤时）只能利用起始起始合成途径（合成途径（De novo pathway）） D途径途径（利用谷酰胺与（利用谷酰胺与尿尿核苷酸单磷酸）核苷酸单磷酸） 合合成成DNA；；有有氨基喋呤（氨基喋呤（A），则，则 D途径途径被氨基喋呤所阻断被氨基喋呤所阻断 杂交瘤细胞具有来自脾淋巴细胞的两个途径，两个途径，次黄嘌呤次黄嘌呤-鸟嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖磷酸核糖转移酶转移酶HGPRT ，起始起始合成途径（De novo pathway），被被氨基喋氨基喋呤呤所阻断但还所阻断但还有补救有补救合成途径（合成途径（有有S途途径）起作用径）起作用脾淋巴细胞与杂交瘤细胞一样：，两个途径中，起始起始合成途径D途径（De novo pathway），虽被氨基被氨基喋呤所阻断，但还有喋呤所阻断，但还有补救补救合成途径（合成途径（S途途径）但是，本身是高度分化的细胞，不能分裂。

但是，本身是高度分化的细胞，不能分裂次黄嘌呤“次黄嘌呤次黄嘌呤”(英语英语:Hypoxanthine)也称也称“6-羟基嘌呤羟基嘌呤”,是一种天然存在的嘌呤衍生物是一种天然存在的嘌呤衍生物6-氨氨基嘌呤，就是腺嘌呤基嘌呤，就是腺嘌呤 阳性阳性孔孔方法方法方法方法————————抗原抗原抗原抗原- - - -抗体杂交法抗体杂交法抗体杂交法抗体杂交法第二次在第二次在多孔培养板多孔培养板上筛选出能产生特异性抗体的上筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞，⑻⑻如何得到大量的单克隆抗体？如何得到大量的单克隆抗体？                                                            体内培养体内培养体外培养体外培养单克隆抗体单克隆抗体 ————化学性质单一、特异性强化学性质单一、特异性强 2.2.2.2.技术思路的重点技术思路的重点技术思路的重点技术思路的重点杂交瘤细胞杂交瘤细胞 HAT筛选筛选McAbMcAb大量培养大量培养PEGPEG诱导细胞融合诱导细胞融合免免免免 疫疫疫疫B 脾脾矿物油矿物油矿物油矿物油骨髓瘤骨髓瘤瘤瘤 关关键键一一步步单克隆抗体（单克隆抗体（McAb）单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程  单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体思考：思考：1 1、本过程利用了哪些原理？、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合细胞融合？？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有的遗传物质，不仅具有B B细胞分泌抗体的能细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体得大量单克隆抗体单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。

应用主要有：应用主要有：1 1、临床诊断、临床诊断2 2、作为载体，运载抗癌药物，形成、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治疗肿瘤治疗肿瘤资料：资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体许多缺乏良好目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势另外，用单克隆抗体做体内克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶病灶”也引起人们的注意，目前，主要用也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断4 4、单抗隆抗体的应用、单抗隆抗体的应用①①作为诊断试剂作为诊断试剂②②定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病              用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、纯度高、纯度高、纯度高、特异性强特异性强特异性强特异性强，具有，具有，具有，具有准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速的优点。

的优点③③用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物              利用同位素标记单抗，在特定组织成像利用同位素标记单抗，在特定组织成像利用同位素标记单抗，在特定组织成像利用同位素标记单抗，在特定组织成像              制成制成制成制成生物导弹生物导弹生物导弹生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置，，将药物定向带到癌细胞所在的位置，，将药物定向带到癌细胞所在的位置，，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小单克隆抗体的优点：单克隆抗体的优点：       特异性强，灵敏度高，并可以大量制备特异性强，灵敏度高，并可以大量制备     ⑵⑵用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物 ① ①特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 生物导弹生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物单克隆抗体＋抗癌药物 ②②疗效高、毒副作用小疗效高、毒副作用小 结合同位素的单抗结合同位素的单抗-----生物导弹生物导弹结合同位素的单抗结合同位素的单抗-----生物导弹生物导弹单抗单抗放射放射性同性同位素位素项目项目项目项目动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物体细胞杂交原理原理原理原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性和细胞膜的流动性和细胞膜的流动性和细胞膜的流动性和植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性融合前提融合前提融合前提融合前提 分散成单个细胞分散成单个细胞分散成单个细胞分散成单个细胞去除细胞壁去除细胞壁去除细胞壁去除细胞壁诱导方法诱导方法诱导方法诱导方法 聚乙二醇、离心、振动、聚乙二醇、离心、振动、聚乙二醇、离心、振动、聚乙二醇、离心、振动、电激、电激、电激、电激、灭活病毒灭活病毒灭活病毒灭活病毒聚乙二醇、离心、聚乙二醇、离心、聚乙二醇、离心、聚乙二醇、离心、振动、电激、振动、电激、振动、电激、振动、电激、结果结果结果结果获得杂种细胞或细胞产物获得杂种细胞或细胞产物获得杂种细胞或细胞产物获得杂种细胞或细胞产物 获得杂种植株获得杂种植株获得杂种植株获得杂种植株用途用途用途用途制备单克隆抗体制备单克隆抗体制备单克隆抗体制备单克隆抗体培育作物新品种培育作物新品种培育作物新品种培育作物新品种意义意义意义意义使远缘杂交成为可能使远缘杂交成为可能使远缘杂交成为可能使远缘杂交成为可能克服远缘杂交障碍克服远缘杂交障碍克服远缘杂交障碍克服远缘杂交障碍植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性、、细胞膜的流动细胞膜的流动性性细胞融合的方法去除细胞壁后诱导去除细胞壁后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后使细胞分散后诱导细胞融合诱导细胞融合诱导方法物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方物理、化学方法（同左）法（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗制备单克隆抗体体小结：小结：两个过程两个过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三个三个“一一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性一个优势－－单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势1.动物细胞工程技术的基础是：（　　　　）动物细胞工程技术的基础是：（　　　　）　　A．动物细胞融合．动物细胞融合　　B．胚胎移植．胚胎移植　　C．动物细胞培养．动物细胞培养　　D．核移植．核移植ＣＣ课堂训练课堂训练２．２．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是确的是（　　）（　　）A．结果是相同的．结果是相同的B．杂种细胞的形成过程基本相同．杂种细胞的形成过程基本相同C．操作过程中酶的作用相同．操作过程中酶的作用相同D．诱导融合的手段相同．诱导融合的手段相同ＢＢ３３. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（（         ））         ①①淋巴细胞　淋巴细胞　②②小鼠骨髓瘤细胞　小鼠骨髓瘤细胞　③③B淋巴细胞自身融合细胞　淋巴细胞自身融合细胞　④④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞　小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞　⑤⑤杂交瘤细胞杂交瘤细胞A．． ②④②④                      B．．①③⑤①③⑤　　　　C．． ①②③④①②③④ 　　          D．．②③②③ C  4、下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产、下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案破伤风杆菌的实验方案(2)、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？(4)、图中、图中B为为________过程，常用过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承___________的遗传特性，既能的遗传特性，既能__________,又能又能___________。

1)、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是__ ________ (3)、、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生该细胞能够产生______(5)、、C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_____培养和培养和_____培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_____代以内的的细胞属于细胞株代以内的的细胞属于细胞株制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC     刚才的发言，如刚才的发言，如有不当之处请多指有不当之处请多指正谢谢大家！　　正谢谢大家！　　47。