生物工程下游技术实验指导.pdf

生物工程下游技术 实验指导 何伟何伟 编编 南京师范大学生命科学院 2006-06 南京师范大学生物学实验教学中心 课程说明 根据教学计划，对理科基地、生物技术、生物教育各专业方向的本科学生开设生物工程 下游技术实验 36 学时现编列 11 个实验项目，供实验教学时选用 生物工程下游技术实验单独设课，1 个学分平时实验操作成绩占 30％，主要考核学生 的预习情况、实验态度、动手能力及操作的规范性、实验结果、实验报告、课堂纪律等情况 期末实验理论考试成绩占 70％ 南京师范大学生物学实验教学中心 实验注意事项 1．自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退 2．实验前必须认真预习，熟悉每次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤 的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验 3．实验过程中要听从教员的指导，严肃认真地接操作规程进行实验，并把实验结果和 数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确完成实验后经教员检查同意， 方可离开实验室 4．实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐公用试剂用毕，应立即盖严放回 原处勿使试剂、药品洒在实验台面和地上实验完毕．仪器须洗净放好，将实验台面抹 拭干净，才能离开实验室。

5．使用仪器、 药品、 试剂和各种物品必须注意节约 洗涤和使用仪器时， 应小心仔细， 防止损坏仪器使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教员， 不得擅自动手检修 6．实验室内严禁吸烟！电炉应随用随关，严格做到：人在火在，人走火灭乙醇、丙 酮、乙醇等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置实验完毕，应立即关好仪器 开关和水龙头，拉下电闸离开实验室以前应认真、负责地进行检查，严防发生安全事故 7．废液体可倒入水槽内，同时放水冲走强酸、强碱溶液必须先用水稀释废纸、火 柴头及其他固体废物和带渣滓的废物倒入废品缸内，不能倒入水槽或到处乱扔 8．仪器损坏时，应如实向教员报告，并填写损坏仪器登记表,然后补领 9．实验室内一切物品，未经本室负责教员批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手 续 10．每次实验课由班长负责安排值日生值日生的职责是负责当天实验室的卫生、安 全和一切服务性的工作 南京师范大学生物学实验教学中心 目录 目录 课程说明课程说明 1 实验注意事项实验注意事项 3 实验一实验一 下游技术的基本操作下游技术的基本操作.4 实验二实验二 发酵液的预处理发酵液的预处理.错误！未定义书签。

实验三实验三 生物组织或微生物细胞的破碎生物组织或微生物细胞的破碎.5 实验四实验四 醋酸丁酯萃取红霉素实验醋酸丁酯萃取红霉素实验.9 买验五买验五 Β－半乳糖苷酶基因Β－半乳糖苷酶基因(LACZ)在大肠杆菌中的表达及活性检测在大肠杆菌中的表达及活性检测11 实验六实验六 植物组织中多糖的提取植物组织中多糖的提取.错误！未定义书签 实验七实验七 离子交换层析分离氨基酸离子交换层析分离氨基酸.错误！未定义书签 实验八实验八 柠檬酸的生产和结晶提取柠檬酸的生产和结晶提取.13 实验九实验九 酵母蔗糖酶的提取和酶活测定酵母蔗糖酶的提取和酶活测定.17 实验十实验十 细胞固定化技术试验细胞固定化技术试验.24 实验十一实验十一 不同方法提取谷胱甘肽的比较不同方法提取谷胱甘肽的比较.27 实验十二实验十二 离子交换树脂交换性能的测定离子交换树脂交换性能的测定.错误！未定义书签 实验十三实验十三 枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的盐析与分析枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的盐析与分析.错误！未定义书签 实验十四实验十四 SOD 的提取与分离的提取与分离 .错误！未定义书签 实验室常识实验室常识 错误！未定义书签 南京师范大学生物学实验教学中心 实验三 生物组织或微生物细胞的破碎 【实验目的实验目的】 练习细胞破碎的各种方法，比较各种方法的优劣。

【实验原理】 随着重组 DNA 技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃很多基固工程 产物都是胞内物质，必须将细胞破壁使产物得以释放才能进一步提取，因此细胞破 碎是提取胞内产物的关键步骤破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、 质量和生产成本现将近年来常用的几种细胞破碎方法介绍一下 (1)机械法：机械法： 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，即可 将动物细胞破碎，这种方法比较温和，适宜实验室使用工业生产中可用电磨研磨 细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组 织打碎， 然后再用 10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组 织的细胞打碎，为了防止发热和升温过高，通常是转 10 秒～20 秒，停 10 秒～20 秒，可反复多次 3) 高压匀浆法：设备是高压匀浆器，它由高压泵和匀浆阀组成，英国 ADv 公司和美国 Microfluidics 公司均有产品出售 其破碎机理：细胞在一系列过程中经历了高速造成 的剪刀碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎。

存在的问题：较易造 成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器质地坚硬易 损伤匀浆阀也不适合用该法处理 4) 高速珠磨法：设备是珠磨机瑞士 WBC 公司和德国西门子机械公司均制造各种型 号的珠磨机 其破碎机下： 微生物细胞悬浮液与授细的研磨荆在搅拌浆作用下充分混 合珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内古 物在珠液分离器的协助下珠子被滞留在破碎室内浆液流出，从而实现连续操 作破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走存在的问题：操作参数多，一般凭 经验估计并且珠子之间的液体损失 30％左右 (2)物理法：物理法： 5) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或 40℃)迅速融 化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞 南京师范大学生物学实验教学中心 溶胀破碎 6) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器破碎微生物细菌 和酵母菌时，时间要长一些，处理的效果与样品浓度和使用频率有关使用时注意 降温，防止过热频高于 15～20KHz 的超声嫂在高强度亩能输入下可以进行细胞破 碎其破碎机理：可能与空化现象弓『起的冲击波和剪切力有关。

超声破碎的效率 与声额、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等固素有关存在问题：超声波破 碎在实验室规模应用较普遍处理步量样品时操作简便液量损失少但是超声波产 生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活 而且大容量装置声能传递， 散 热均有困难 7) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法在 90℃左右维持数分 钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎 (3)化学与生物化学方法：化学与生物化学方法： 1) 化学渗透法：某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变 性剂等化学药品都可改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来其 作用机理：化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成存在的 问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较强同时对产物也有毒害作用进一步分 离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类 型的微生物细胞 2) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于 37℃，pH8， 处理 15 分钟，可以专一性地将细胞壁分解，释放出细胞内含物，此法适用于多种微 生物。

例如从某些细菌细胞提取质粒 DNA 时，可采用溶菌酶（来自蛋清）破细胞 壁，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶（来自蜗牛） ，将酵母细胞悬于 0.1mmol/L 柠 檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH=5.4)中，加 1％蜗牛酶，在 30℃处理 30 分钟，即可使 大部分细胞壁破裂，如同时加入 0.2％疏基乙醇效果会更好此法可以与研磨法联合 使用 3) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠） 等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法 联合使用微生物的代谢产物有分泌到胞外的，用适当的有机溶剂可以直接提取； 而对胞内产物提取，则首先要将细胞破碎 微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜，细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁 除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的 各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到 溶液中，并不丢失生物活性不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破 南京师范大学生物学实验教学中心 碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和 微生物由于具有较坚固的纤维素、 半纤维素组成的细胞壁， 要采取专门的细胞破碎方法。

本实验采用研磨、超声波、化学处理的方法对酵母细胞进行细胞破碎 【实验材料】 (一) 器材 研钵，JY92-Π型超声波细胞破碎机，离心机，水浴锅，普通光学显微镜，载玻片，盖 玻片，酒精灯，接种环，双层瓶，擦镜纸，量筒，烧杯，移液管 (二) 试剂 (1) 25％SDS 溶液: 25 克 SDS 溶于 100ml 蒸馏水 (2) Tris-HCl 缓冲液(pH7.4): 50ml 0.1mol/l 三羟甲基氨基甲烷(Tris)与 42ml 0.1mol/l 盐酸 混匀后,加水稀释至 100ml (3) 复红染液 (4) NaCl-EDTA 水溶液：0.3mol/l NaCl，0.2mol/l EDTA，pH8.0 【实验步骤】 1. 细胞培养和收集 将活化酵母菌株接入马铃薯培养基中，于 30℃摇床培养在对数生长期离心收集细胞， 制成湿菌体 2. 细胞的破碎 (1) 研磨法 取干菌体 0.5 克，研磨 10min，加 1ml 蒸馏水置于研钵中，再研磨十分钟取少许于 5ml 试管中加 5ml 蒸馏水稀释取一滴稀释菌液镜检 (2) 超声波法 取 5ml 菌悬液于 10ml 离心管中，经超声波细胞破碎机破碎菌体，工作时间 3s，间歇时 间 3s，工作功率 500W，总时间 3min。

超声后加 5ml 蒸馏水，取一滴菌液镜检 (3) 化学处理法 取 5ml 菌悬液，加 4ml NaCl-EDTA 水溶液中，加入 1ml 25％SDS 于 60℃保温 15min 取一滴菌液镜检 (4) 微波处理 微波炉，高档，每组菌悬液 5ml，工作时间 5 秒，冷却至室温，总工作时间 3min） 处 理后加 5ml 蒸馏水稀释取一滴菌液镜检 (5) 冻融 每组取菌悬液 1ml，10min、-20℃冰冻，60℃热水解冻，反复 3 次处理后加 1ml 蒸馏 南京师范大学生物学实验教学中心 水稀释，取一滴菌液镜检 【实验结果】 对上述各种方法破碎细胞进行涂片，镜检每种方法镜检时，每次取 5 个视野数出破碎 细胞的个数并算出平均值对比各种方法的破碎细胞数量 【问题与思考】 1. 记录镜检结果 2. 试比较研磨，超声波，化学处理的方法进行细胞破碎在实际生产中的优缺点 南京师范大学生物学实验教学中心 实验四 醋酸丁酯萃取红霉素实验 【实验目的实验目的】 从发酵液中提取红霉素 【实验原理】 生化固液分离中最困难的操作常常是从细胞破碎后的匀浆中移走细胞碎片这些碎片尺 寸分布很广，有细胞壁碎片，还有完整的细胞器、未破碎的细胞等等。

用离心机分离常常要 在几万转下运行几十分钟以上，还不容易除掉某些絮状小碎片；用膜分离不仅速度慢，还易 出现膜污染和蛋白质滞留 萃取是化学工程中常用的单元操作，常用的组分是水相和有机相，利用被提取物在两相 中的分配不同而实现分离的目的 根据红霉素在有机溶剂和水溶液中溶解度的不同，将醋酸。