实验九底物浓度对酶促反应速度的影响.ppt

底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响  实验目的实验目的 1 1 了解底物浓度对酶促反应速度的影响了解底物浓度对酶促反应速度的影响 2 2 学习测定米氏常数的原理和方法学习测定米氏常数的原理和方法 实验原理实验原理19131913年，年，MichaelisMichaelis和和MentenMenten提出了酶促反应速度和底物浓度提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式，即米氏方程的关系式，即米氏方程υυ＝＝V V×[S] / ( [S] / ( Km+[SKm+[S] )] )式中：式中： υυ为反应初速度为反应初速度 V V为最大反应速度为最大反应速度 [S][S]为底物浓度为底物浓度 KmKm为米氏常数为米氏常数 KmKm值是酶的一个特征性常数，可近似表示酶与底物的亲和力值是酶的一个特征性常数，可近似表示酶与底物的亲和力 LineweaverLineweaver-Burk-Burk作图法是用实验方法测定作图法是用实验方法测定KmKm值的最常用的值的最常用的方法。

方法LineweaverLineweaverLineweaverLineweaver––––BurkBurkBurkBurk的作图法的作图法的作图法的作图法 ———— 双倒数作图法双倒数作图法双倒数作图法双倒数作图法 1 Km 1 1  =     +  V Vmax [S] Vmax取米氏方程式的倒数形式：取米氏方程式的倒数形式：取米氏方程式的倒数形式：取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/KmØ米氏常数米氏常数KmKm的的测定测定n 实实验验时时选选择择不不同同的的[S][S]，，测测定定相相对对应应的的υυ求求出出两两者者的的倒倒数数，，以以1/υ1/υ对对1/[S]1/[S]作作图图，，则则得得到到一一个个斜斜率率为为K Km m/V/V的的直直线线将将直直线线外外推推与与横横轴轴相相交交，，其其横横轴轴截截矩矩为为：：－－1/[S]1/[S]＝＝1/ 1/ K Km m，，由由此此求求出出K Km m值值。

该法比较简便该法比较简便n 本本实实验验以以胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化酪酪蛋蛋白白为为例例，，采采用用LineweaverLineweaver-Burk-Burk双倒数作图法测定双倒数作图法测定K Km m值n 胰胰蛋蛋白白酶酶能能催催化化蛋蛋白白质质中中碱碱性性氨氨基基酸酸（（L L－－精精氨氨酸酸和和L L－－赖赖氨氨酸酸））的的羧羧基基所所形形成成的的肽肽键键水水解解水水解解时时生生成成自自由由氨氨基基酸酸，，故故可可用用甲甲醛醛滴滴定定法法判判断断自自由氨基增加的数量来追踪反应由氨基增加的数量来追踪反应n甲甲醛醛滴滴定定法法 由由于于氨氨基基酸酸分分子子在在溶溶液液中中主主要要是是两两性性离离子子，，故故不不能能用用酸酸、、碱碱滴滴定定其其含含量量但但氨氨基基酸酸的的氨氨基基可可与与甲甲醛醛反反应应生生成成羟羟甲甲基基和和二二羟羟甲甲基基氨氨基基酸酸，，使使上上述述平平衡衡向向右右移移动动，，促促使使氨氨基基酸酸分分子子上上的的一一NH3NH3十十基基解解离离释释放放出出 H+H+，，从从而而使使溶溶液液酸酸性性增增加加，，就就可可以以酚酚酞酞作作指示剂用指示剂用 NaOHNaOH来滴定。

来滴定n小知识点：小知识点：n酚酞是碱性指示剂（变色范围是碱性），酸滴酚酞是碱性指示剂（变色范围是碱性），酸滴碱时用碱性指示剂；反之碱滴酸时用酸性指示碱时用碱性指示剂；反之碱滴酸时用酸性指示剂比如甲基橙甲基红剂比如甲基橙甲基红 n三、器材三、器材 n 锥形瓶锥形瓶 滴定管滴定管 移液管移液管 水浴锅水浴锅 量量筒等筒等n四、试剂与材料四、试剂与材料n 1. 1. 酪蛋白酪蛋白n 2. 2. 胰蛋白酶胰蛋白酶n 3. 3. 甲醛甲醛n 4. 4. 酚酞酚酞n 5. 5. 氢氧化钠氢氧化钠 五、操作五、操作 分分别别向向6 6个个小小锥锥形形瓶瓶中中加加入入5 5 mLmL甲甲醛醛溶溶液液和和1 1滴滴酚酚酞酞，，并并滴滴加加0.1 0.1 mol/Lmol/L标标准准氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液，，直直至至混混合合物物呈呈微微粉粉红红色色注注意意：：每每个个锥锥形形瓶瓶中中的的颜颜色色应应一致 取取100 100 mLmL酪酪蛋蛋白白溶溶液液，，加加入入另另一一锥锥形形瓶瓶中中，，在在37℃37℃水水浴浴中中保保温温1010分分钟钟。

将将胰胰蛋蛋白白酶酶也也在在37 37 ℃℃水水浴浴中中保保温温1010分分钟钟然然后后精精确确量量取取10 10 mLmL酶酶液液加加到到酪酪蛋白溶液中（同时计时）蛋白溶液中（同时计时） • 充充分分混混合合后后，，随随即即取取出出10 10 mLmL反反应应混混合合物物（（作作为为零零时时的的样样品品））吹吹至至一一含含甲甲醛醛的的锥锥形形瓶瓶中中用用0.1 0.1 mol/mol/LNaOHLNaOH溶溶液液滴滴定定，，直直至至混混合合物物呈呈微微粉粉红色，红色，记下所用记下所用0.1 mol/0.1 mol/LNaOHLNaOH溶液的溶液的mLmL数 在在2 2、、4 4、、6 6、、8 8和和1010分钟时，分别取出分钟时，分别取出10 10 mLmL消化消化样品，准确照上法操作注意：在每个样品中滴定终样品，准确照上法操作注意：在每个样品中滴定终点的颜色应当一致用增加的滴定度对时间作图，测点的颜色应当一致用增加的滴定度对时间作图，测定初速度定初速度 配制不同浓度的酪蛋白溶液（配制不同浓度的酪蛋白溶液（7.57.5、、1010、、1515、、2020、、30 g/L30 g/L）测定不同底物浓度时的活力。

测定不同底物浓度时的活力 用实验测得的结果，以以用实验测得的结果，以以1/υ1/υ对对1/[S]1/[S]作图，求作图，求出出V V和和KmKm的数值 n【【注意事项注意事项】】n1 1．实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，．实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降原因随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pHpH及温度下及温度下部分失活等因此，研究酶的活力以酶促反应的初速部分失活等因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准n2 2．本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结．本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差因此配制各果，应尽量减少实验操作中带来的误差因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性各种试剂的加量也应准确，并严格控制准的准确性。

各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间确的酶促反应时间n【【实验结果实验结果】】n1 1．测定并计算酶促反应速度．测定并计算酶促反应速度n2 2．用实验所得的反应速度，对相应的底物浓．用实验所得的反应速度，对相应的底物浓度作图n【【实验报告实验报告】】n总结实验结果，并回答如下问题：总结实验结果，并回答如下问题：n1 1．． 试述底物浓度对酶促反应速度的影响试述底物浓度对酶促反应速度的影响n2 2．． 在什么条件下，测定酶的在什么条件下，测定酶的KmKm值可以作为鉴值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？定酶的一种手段，为什么？n3 3．． 米氏方程中的米氏方程中的KmKm值有何实际应用？值有何实际应用？。