项目五任务二三微生物菌种选育课件.pptx

项目五任务二 食品微生物育种基本程序及操作一、菌种的来源一、菌种的来源v根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；v从大自然中分离筛选新的微生物菌种二、分离思路二、分离思路 v新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来v实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化v有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合v定定方方案案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性v采样：采样：有针对性地采集样品v增增殖殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势v分分离离筛筛选选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目的菌v发发酵酵性性能能测测定定：进行生产性能测定这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤（一）采样一）采样1、采样对象 以采集土壤为主一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。

采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等从自然界筛选从自然界筛选v2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好v3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离采取土壤样品要考虑的几个问题采取土壤样品要考虑的几个问题v土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗性真菌v离地面520cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含菌量最高v采土季节以春秋两季最好v采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、地点、植被情况等v多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分布平均情况（二）增殖培养（二）增殖培养v含有目的菌较多的土样不需要富集培养v如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖，从而提高它们在样品中的比例，便于分离v富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体中比例上升的目的。

v 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多v一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通过大量艰苦的工作筛选取得某些细菌的富集条件某些细菌的富集条件 富集对象 接种菌样添加营养物(g)特殊培养条件好氧氨基酸氧化菌土壤好氧，pH7.0好氧性芽孢杆菌土壤，巴氏消毒 好氧，pH7.0氨基酸发酵性梭菌土壤，巴氏消毒 厌氧，pH7.0耐碱解尿素芽孢菌土壤，巴氏消毒 尿素50 好氧，pH8.6 厌氧八叠球菌土壤 葡萄糖20厌氧，pH23 乳酸菌植物体或牛奶 葡萄糖20厌氧，pH6.5 肠道细菌土壤或污水葡萄糖20，CaCO320好氧或厌氧，pH7.0 丙酸菌干酪 乳酸钠20厌氧，pH7.0 醋酸菌果实或生啤酒 乙醇40 好氧，pH6.0注：培养基成分为酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO4 1.0g，MgSO47H2O 0.2g，加水1000ml一般培养在30下三）培养分离纯化（三）培养分离纯化v 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。

因此还必须分离，纯化在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法稀释分离法稀释分离法 稀释倒稀释倒 平板法平板法 平板平板 涂布法涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板划线分离法划线分离法平板划线法平板划线法（四）筛（四）筛 选选1、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物 筛选出来的过程筛选出来的过程常用的初选方法：常用的初选方法：水解酶产生菌的筛选：水解酶产生菌的筛选：将酶的作用底物加在培将酶的作用底物加在培 养基中，接种后适温培养基中，接种后适温培 养，根据菌苔周围是否养，根据菌苔周围是否 产生水解圈筛选出水解产生水解圈筛选出水解 酶产生菌酶产生菌一般采用平板筛选一般采用平板筛选拮抗菌的筛选拮抗菌的筛选对峙培养：对峙培养：将病原指示菌与待测菌株将病原指示菌与待测菌株 相对接种在平板上适温培相对接种在平板上适温培 养，根据病原菌的生长情养，根据病原菌的生长情 况筛选出拮抗性菌株况筛选出拮抗性菌株分初筛、复筛分初筛、复筛2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取 发酵滤液进行活力测定。

发酵滤液进行活力测定2、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的 生产能力强弱的过程生产能力强弱的过程复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法 进行测定进行测定复筛过程中，要结合培养条件进行复筛过程中，要结合培养条件进行培养条件包括：培养基培养条件包括：培养基 pH值值 发酵温度发酵温度 供氧量等供氧量等五）菌种鉴定（五）菌种鉴定v 经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特征、血清学试验等征、血清学试验等v现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组分、计算机数值分析分、计算机数值分析六）毒性试验（六）毒性试验v 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验任务三 食品微生物育种技术一、诱变育种中的几个原则一、诱变育种中的几个原则 指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。

率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株2个主要环节：个主要环节：诱变（随机）诱变（随机）选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高筛选（定向）筛选（定向）设计有效的筛选方法，将少量正变株中的设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来优良菌株挑选出来一）（一）出发菌株（出发菌株（original strain）出发菌株出发菌株指用于诱变育种的起始菌株指用于诱变育种的起始菌株具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、标记明显等）；标记明显等）；对诱变剂敏感对诱变剂敏感野生型菌株；野生型菌株；从生产中选育的自发突变菌株；从生产中选育的自发突变菌株；诱变获得的高产菌株诱变获得的高产菌株出发菌株的选择标准：出发菌株的选择标准：出发菌株的来源：出发菌株的来源：二、诱变育种的方法二、诱变育种的方法（二）（二）菌悬液的制备菌悬液的制备1.选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）目的：目的：使每个细胞能均匀接触诱变剂；使每个细胞能均匀接触诱变剂；减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）2.同步培养（生理状态一致）同步培养（生理状态一致）3.菌龄：对诱变剂最敏感时期菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期孢子或芽孢：萌发前期4.4.菌悬液的制备方法菌悬液的制备方法 物理诱变：生理盐水配制物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制化学诱变：缓冲液配制5.菌悬液的浓度菌悬液的浓度 酵母菌，霉菌的孢子：酵母菌，霉菌的孢子：10106 6个个/mL /mL 细菌，放线菌孢子：细菌，放线菌孢子：10108 8个个/mL/mL（三）诱变剂的选择及处理方法（三）诱变剂的选择及处理方法1.诱变剂的选择（高效，简便）诱变剂的选择（高效，简便）物理诱变剂：物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便；频度低、大损伤，难修复，且操作简便；化学诱变剂：化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。

频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦NTG超诱变剂）超诱变剂）UV是最常用的一种诱变剂是最常用的一种诱变剂2.剂量的选择剂量的选择 突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量高剂量,反而会使突变率下降反而会使突变率下降正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为7075%,甚至甚至3070%的剂量的剂量UV的剂量:固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异向正突变范围移动的剂量又能使变异向正突变范围移动的剂量常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）3.诱变处理方法诱变处理方法单因素处理或多因素的复合处理：单因素处理或多因素的复合处理：同一诱变剂的重复使用；同一诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱变剂的同时使用两种或多种诱变剂的同时使用.（四）（四）中间培养（中间培养（CM，培养过夜），培养过夜）目的：克服表型延迟目的：克服表型延迟表型延迟表型延迟（phenotypiclag）：表型的改变落后于基因型改变的表型的改变落后于基因型改变的 现象现象.分离性延迟：分离性延迟：突变的基因经突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯复制和细胞分裂后变成纯 合状态，表型才能表现出来合状态，表型才能表现出来。

生理性延迟：生理性延迟：由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 表现出来表现出来分离性延迟的原因分离性延迟的原因:对数生长期中，单核细胞常出现双核对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象象称为分离延迟现象生理性延迟的原因生理性延迟的原因:当变异细胞由杂合状态变为纯合状态当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必必须经过细胞多代分离后须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉才能将这些非变异的酶稀释掉,最终最终达到变异后应该表现的形态达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过如营养缺陷型突变株的筛选过程五）突变株的筛选（五）突变株的筛选 初筛初筛 复筛复筛1.初筛（。