复合肥料中多肽含量的测定.pdf

T/CPFIA XXXXXXXX 8 A B 附 录 A（规范性附录）复合肥料中多肽含量的测定 A.1 原理 试样用IEC氨基酸分析法测定游离氨基酸总含量试样用三氯乙酸预处理，去除沉淀大分子蛋白质，提取多肽氨基酸和游离氨基酸，用盐酸溶液全部水解，用IEC氨基酸分析法测定酸溶蛋白含量多肽即为酸溶蛋白含量与游离氨基酸总含量的差值A.2 试剂 实验用水应符合GB/T 6682中一级用水的规格使用试剂除特殊规定外，均为分析纯A.2.1 柠檬酸钠（Na3C6H5O72H2O）A.2.2 盐酸（优级纯）A.2.3 乙二胺四乙酸二钠溶液：10g/LA.2.4 盐酸水解溶液（6mol/L）：将500mL盐酸（A.2.2）与500mL水混合，加1g苯酚，混匀A.2.5 三氯乙酸溶液（150g/L）：称取150g三氯乙酸，加水溶解并定容至1000mL，混匀A.2.6 柠檬酸钠缓冲液pH=2.2，c（Na+）=0.2mol/L：称取19.6g柠檬酸钠（A.2.1），用水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加入16.5mL盐酸（A.2.2），硫二甘醇5.0mL，苯酚1g，用水定容并过滤A.2.7 氨基酸标准储备溶液：含天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸共17种氨基酸，各组分浓度均为2.5mol/mL，应使用有证标准溶液。

A.2.8 氨基酸标准工作溶液：准确移取2mL的氨基酸标准储备溶液（A.2.6）置于50mL容量瓶中，以柠檬酸钠缓冲溶液（A.2.5）定容，各氨基酸组分浓度为100nmol/mL，用安瓿分装密封，每支约1mL，在28下保存，有效期3个月A.2.9 不同pH值和离子强度的柠檬酸钠缓冲溶液与茚三酮溶液：按照仪器说明书配制或购买A.2.10 液氮A.3 仪器与设备 A.3.1 天平：感量0.1mg和0.01mgA.3.2 氨基酸自动分析仪：具备阳离子交换柱、茚三酮柱后衍生装置及570nm和440nm光度检测器A.3.3 离心机：转速不低于4000r/minT/CPFIA XXXXXXXX 9 A.3.4 真空泵A.3.5 喷灯A.3.6 恒温干燥箱：温度可达1102A.3.7 旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65间调温，控温精度1，真空度可低至3.3103Pa(25mmHg)A.4 操作步骤 A.4.1 试样的制备 固体样品经多次缩分后，取出约100g，将其迅速研磨至全部通过0.25mm孔径筛，混合均匀，置于洁净、干燥容器中A.4.2 试样溶液的制备 称取试样5g，精确至1mg，置于250mL具塞三角瓶中。

在1035条件下，准确加入100mL三氯乙酸溶液（A.2.5）（如样品形成小球或者团块，先均质后再振荡提取）对于固态试样，摇匀后，于150r/min振荡30min将上层溶液倒入100mL离心管中，4000r/min离心5min,上清液为试样提取液如上层溶液有漂浮物，需过滤称上述取试样提取液0.5mL5mL（精确至0.1mg），置于20mL安瓿或水解管中，加适量水至溶液总体积为5mL，再加入10mL盐酸水解溶液（A.2.4），置液氮（A.2.10）中冷冻，使用真空泵抽真空至7Pa（510-2mmHg）后用喷灯封口或充氮气1min后旋紧管盖将安瓿或水解管放在1102恒温干燥箱中，水解22h24h冷却，混匀，开管，过滤，用移液管精确吸取适量的滤液，置于旋转蒸发器或浓缩器中，60下抽真空蒸发至干，必要时，加少许水，重复蒸干1次2次加入3mL5mL柠檬酸钠缓冲溶液（A.2.6）复溶，使试样溶液中氨基酸浓度达到50nmol/mL250nmol/mL，摇匀，过滤或离心，上清液待上机测定注：当试样中含有金属元素时，则在“冷却，混匀，开管”后吸取水解液2mL，准确加入10g/L的乙二胺四乙酸二钠溶液（A.2.3）2mL，混匀，然后按“过滤，用移液管精确吸取适量的滤液上清液待上机测定”进行操作。

A.4.3 测定 将氨基酸标准工作溶液(A.2.8)注入氨基酸分析仪，以不同pH值和离子强度的柠檬酸钠缓冲溶液与茚三酮溶液（A.2.9）作为流动相和衍生剂，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配比，应符合JJG 1064氨基酸分析仪检定规程的要求，并保证苏氨酸-丝氨酸，甘氨酸-丙氨酸以及亮氨酸-异亮氨酸分离度分别不得小于85%、90%、80%注入制备好的试样溶液和相应的氨基酸标准工作溶液进行测定，每5个样品（即10个单样）为一组，组间插入氨基酸标准工作溶液（A.2.8）进行校准以保留时间定性，单点外标法定量试样中氨基酸的峰面积应在标准工作溶液相应峰面积的30%200%,否则应用柠檬酸钠缓冲溶液（A.2.6）稀释后重测A.4.4 游离氨基酸含量的测定 按NY/T 1975的规定测定游离氨基酸的含量A.4.5 分析结果的表述 A.4.5.1 酸溶蛋白含量以质量分数1计，数值以百分率（%）表示，按式（A.1）计算 T/CPFIA XXXXXXXX 10 .(A.2)式中：k氨基酸的种类数；n试样水解溶液稀释倍数；Ai试样溶液中第i种氨基酸的峰面积；Vhv试样水解溶液体积，单位为毫升（mL）；ci标准工作溶液中第i种氨基酸的浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL）；Mi第i种氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol）；Vst0氨基酸标准溶液进样体积，单位为微升（L）；Asti氨基酸标准溶液中第i种氨基酸的峰面积；m试样的质量，单位为毫克（mg）；V0试样溶液进样体积，单位为微升（L）；以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。

A.4.5.2 多肽含量以质量分数计，数值以百分率（%）表示，按式（A.2）计算 =1-2.(A.2)式中：试样中多肽的含量，单位为百分率（%）；1试样中酸溶蛋白含量，单位为百分率（%）；2试样中游离氨基酸的含量，单位为百分率（%）A.4.6 允许差 A.4.6.1 平行测定结果的允许差 酸溶蛋白含量平行测定结果的相对相差不大于10%；游离氨基酸含量平行测定结果的允许差按NY/T 1975的规定执行A.4.6.2 不同实验室测定结果的允许差 多肽含量不同实验室测定结果的相对相差不大于20%。