毕业论文：小鼠microRNA-125b过表达载体构建

小鼠microRNA-125b过表达载体构建 目 录摘要1Abstract31 前言42 材料与方法52.1 材料52.2主要试剂与仪器52.2.1主要试剂52.2.2主要仪器52.3 方法62.3.1质粒提取62.3.2鼠尾基因组DNA提取62.3.3 PCR引物设计与合成72.3.4 PCR扩增72.3.5琼脂糖凝胶电泳检测72.3.6 DNA产物纯化及回收82.3.7酶切及鉴定82.3.8载体构建93 结果与分析94 讨论115 结论116 参考文献12致谢14 摘 要NPC1是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病，迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释。研究发现miRNA对tau蛋白的调控和神经元存活至关重要，通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶来调节tau蛋白磷酸化水平。Tau 蛋白过度磷酸化损伤神经细胞功能和结构，如过度磷酸化使Tau 蛋白结合微管能力降低1，Tau 蛋白在神经元内聚积导致神经元轴突转运障碍2、乙酰胆碱释放减少3、蛋白酶体活性抑制4-7，这些功能和结构的改变可能导致神经元呈慢性进行性变性构建miR-125b表达载体，从tau蛋白磷酸化调控的研究入手，系统地研究参与tau蛋白磷酸化调控的miR-125b的靶基因，阐释其中的分子作用机制，为tau蛋白异常病变引起的神经退行性疾病的研究与防治提供新的思路。 本实验目的：构建小鼠microRNA-125b（miR-125b）过表达载体。方法：参考小鼠miR-125b前体序列的PCR扩增引物，重新设计限制性内切酶位点为Nhe I和EcoR I，PCR扩增，然后将目的片段和pcDNA3.1-EGFP质粒进行双酶切鉴定，使用T4 DNA连接酶进行连接，转化DH5感受态细胞，挑取重组阳性克隆，对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。结果：菌液PCR筛选鉴定出正确的miR-125b过表达载体，测序分析证实克隆的基因序列正确。结论：成功构建小鼠miR-125b的真核表达载体，为进一步研究miR-125b在C1型尼曼-匹克病中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。关键词：microRNA-125b；pcDNA3.1-EGFP；过表达载体17Construction of microRNA-125b overexpression vector in mouseAbstract Objective To construct the microRNA-125b(miR-125b) overexpression vector in mouse. Methods PCR amplification primers of miR-125b precursor sequence referred to article, we redesigned restriction enzymes for Nhe I and EcoR I. After being confirmed by PCR amplification, the target fragment and pcDNA3.1-EGFP plasmid were identified by double digestion., and connected using T4 DNA ligase. Then, it was transformed in DH5 competent cells. Finally, the recombinant plasmid were picked, and identified by double digestion, agarose gel electrophoresis and DNA sequencing. Results miR-125b precursor sequence was successfully inserted into pcDNA3.1-EGFP plasmid by identification of DNA sequencing. Conclusion The eukaryotic expression vector of mouse miR-125b has been successfully constructed, which provides a foundation for further studying the mechanism of tau phosphorylation regulated by miR-125b in Niemann-Pick type C1 disease.Key words: microRNA-125b, pcDNA3.1-EGFP, Overexpression vector学士学位论文一、前言microRNA（miRNA，微小RNA）是一类长约20-24个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，进化上具有高度保守性，广泛存在于真核生物中。成熟miRNA能够与靶基因3UTR以完全互补或不完全互补的形式结合，诱导靶mRNA降解或抑制蛋白翻译，导致相应蛋白质合成缺失或减少，从而在转录水平、转录后水平、表观遗传水平等调控基因表达，参与生命过程中一系列的重要进程1。到目前为止，在人类和小鼠中分别发现超过1000和750种miRNA，其中一些主要在大脑中表达2-4，人类有接近1/3的基因受到miRNA的调控5。近年来的大量研究表明，miRNA的异常表达广泛参与了肿瘤、心血管疾病和糖尿病等重大疾病的发生与发展。同时，miRNA也参与了神经系统生长发育和生理功能的调控，其表达异常与神经退行性疾病的发生发展相关6。C1型尼曼-匹克病（Niemann-Pick disease type C1, NPC1）是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病，迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释7,8。研究表明，tau蛋白和A（Amyloid beta，-淀粉样蛋白）在神经退行性病变中紧密联系，存在协同作用。tau蛋白在调节轴突运输功能的同时，亦参与A的致病机制，加剧A导致的神经元毒性、微管丢失、神经炎症变化等，进而导致神经变性和学习记忆障碍，揭示tau蛋白在神经元细胞变性的发生发展中起重要作用9,10。目前，虽然对tau蛋白参与神经退行性疾病的具体机理尚不明确，但已证实，抑制神经元tau蛋白过度磷酸化可以有效缓解神经退行性病变的发生和发展11。miRNA对tau蛋白磷酸化的调控和神经元存活至关重要，通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的表达来调控tau蛋白磷酸化水平。miR-125b在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）中的发病机理是促进tau蛋白过度磷酸化。miR-125b超表达会引起tau蛋白过度磷酸化，分别上调蛋白激酶p35、cdk5和p44/42-MAPK和下调蛋白磷酸酯酶DUSP6、PPP1CA及抗凋亡因子Bcl-W的表达。抑制蛋白磷酸酯酶的表达会导致tau蛋白过度磷酸化，超表达PPP1CA和Bcl-W会阻止miR-125b引起的过度磷酸化，证实蛋白磷酸酯酶可以调节miR-125b对tau蛋白的影响。然而，抑制神经元中miR-125b的表达会降低tau蛋白过度磷酸化和蛋白激酶活性。另外，在小鼠海马内注射miR-125b会损害联想学习以及下调DUSP6、PPP1CA和Bcl-W表达，并增强tau蛋白过度磷酸化12。本研究构建了小鼠miR-125b的真核过表达载体，为进一步研究miR-125b在C1型尼曼-匹克病中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。二、材料与方法2.1 材料BALB/c小鼠、大肠杆菌DH5感受态细胞、pcDNA3.1-EGFP质粒均由实验室保存。2.2主要试剂与仪器2.2.1主要试剂PurePlasmid Mini Kit、2×Es Taq MsterMix（康为世纪）、DNA Fragment Purification kit（TaKaRa）、10×quick cut Buffer、10×quick cut Green Buffer、QuickCutTM Nhe I、QuickCutTM EcoR I、ddH2O、10×T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase Buffer、LB液体培养基、LB固体培养基、DNA Marker 2000bp、水合氯醛、琼脂糖、EB。2.2.2主要仪器本研究所用主要仪器的名称和生产厂家见表1。表1 主要实验仪器仪器生产厂家96孔梯度PCR仪ABI公司水浴锅北京光明医疗仪器有限公司高压灭菌锅上海申安医疗器械场恒温摇菌摇床江苏海门其林医用仪器厂台式高速冷冻离心机SIGMANanodrop 2000分光光度计Thermo单人双面净化作台苏州净化设备有限公司电子天平上海精天电子电泳仪北京市六一仪器厂凝胶成像系统Uvitec公司10µl微量移液枪Eppendorf100µl微量移液枪Eppendorf1000µl微量移液枪Eppendorf电热恒温培养箱北京中兴伟业仪器有限公司气浴恒温振荡器上海比朗仪器有限公司低温恒温槽上海平轩科学仪器有限公司2.3 方法2.3.1质粒提取1、将3ml的pcDNA3.1-EGFP菌液加入到1.5ml离心管中，6000rpm离心5min，弃上清。2、向沉淀中加入250µl Buffer P1（已加入RNase A），悬浮沉淀。3、向离心管中加入250µl Buffer P2，缓慢的上下颠倒混匀，直到溶液变得清亮粘稠。4、其后加入350µl Buffer N3，温和的上下颠倒，直至出现白色絮状沉淀后，12000rpm离心15min。5、离心后的产物弃上清，移入已装收集管的吸附柱中12000rpm离心1min，弃废液。随后加入500µl Buffer PB 12000rpm离心1min，再加入750µl Buffer PW12000rpm离心1min，弃废液，室温晾干，吸附柱至于新的离心管中，向膜上加入100µl Buffer EB，放置3min 12000rpm离心1min。6、1%的胶进行电泳。2.3.2鼠尾基因组DNA提取1、取5mm鼠尾切成小块置于1.5ml离心管中，加入180µl Buffer GTL。2、向离心管中加入20µl Proteinase K，振荡使样品彻底混匀。3、向离心管中加入200µl BufferGL，振荡充分混匀，加入200µl无水乙醇，振荡充分混匀。4、将上一步溶液全部加入已放入Collection Tube的Spin Column DM中，8000rpm离心1min，弃废液。5、向Spin Column DM中加入500µl已加入无水乙醇的Buffer GW1，8000rpm离心1min，弃废液。6、向Spin Column DM中加入500µl已加入无水乙醇的Buffer GW2，14000rpm离心1min，弃废液。7、12000rpm离心1min，置于室温放置数分钟彻底晾干吸附材料中残余的BufferGW2。8、将吸附柱转入一个新的离心管中，向吸附膜的中间悬空加入200µl灭菌水。9、室温放置5min，8000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。2.3.3 PCR