毕业论文:小鼠microRNA-125b过表达载体构建
18页1、 小鼠microRNA-125b过表达载体构建 目 录摘要1Abstract31 前言42 材料与方法52.1 材料52.2主要试剂与仪器52.2.1主要试剂52.2.2主要仪器52.3 方法62.3.1质粒提取62.3.2鼠尾基因组DNA提取62.3.3 PCR引物设计与合成72.3.4 PCR扩增72.3.5琼脂糖凝胶电泳检测72.3.6 DNA产物纯化及回收82.3.7酶切及鉴定82.3.8载体构建93 结果与分析94 讨论115 结论116 参考文献12致谢14 摘 要NPC1是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病,迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释。研究发现miRNA对tau蛋白的调控和神经元存活至关重要,通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶来调节tau蛋白磷酸化水平。Tau蛋白过度磷酸化损伤神经细胞功能和结构,如过度磷酸化使Tau蛋白结合微管能力降低1,Tau蛋白在神经元内聚积导致神经元轴突转运障碍2、乙酰胆碱释放减少3、蛋白酶体活性抑制4-7,这些功能和结构的改变可能导致神经元呈慢性进行性变性构建miR-125b表达载体,从tau蛋白磷酸化调控的
2、研究入手,系统地研究参与tau蛋白磷酸化调控的miR-125b的靶基因,阐释其中的分子作用机制,为tau蛋白异常病变引起的神经退行性疾病的研究与防治提供新的思路。 本实验目的:构建小鼠microRNA-125b(miR-125b)过表达载体。方法:参考小鼠miR-125b前体序列的PCR扩增引物,重新设计限制性内切酶位点为Nhe I和EcoR I,PCR扩增,然后将目的片段和pcDNA3.1-EGFP质粒进行双酶切鉴定,使用T4 DNA连接酶进行连接,转化DH5感受态细胞,挑取重组阳性克隆,对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。结果:菌液PCR筛选鉴定出正确的miR-125b过表达载体,测序分析证实克隆的基因序列正确。结论:成功构建小鼠miR-125b的真核表达载体,为进一步研究miR-125b在C1型尼曼-匹克病中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。关键词:microRNA-125b;pcDNA3.1-EGFP;过表达载体17Construction of microRNA-125b overexpression vector in mouseAbstract
3、Objective To construct the microRNA-125b(miR-125b) overexpression vector in mouse. Methods PCR amplification primers of miR-125b precursor sequence referred to article, we redesigned restriction enzymes for Nhe I and EcoR I. After being confirmed by PCR amplification, the target fragment and pcDNA3.1-EGFP plasmid were identified by double digestion., and connected using T4 DNA ligase. Then, it was transformed in DH5 competent cells. Finally, the recombinant plasmid were picked, and identified by
4、 double digestion, agarose gel electrophoresis and DNA sequencing. Results miR-125b precursor sequence was successfully inserted into pcDNA3.1-EGFP plasmid by identification of DNA sequencing. Conclusion The eukaryotic expression vector of mouse miR-125b has been successfully constructed, which provides a foundation for further studying the mechanism of tau phosphorylation regulated by miR-125b in Niemann-Pick type C1 disease.Key words: microRNA-125b, pcDNA3.1-EGFP, Overexpression vector学士学位论文一、
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