各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看).doc
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。酶寡核苷酸序列链长切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 >90 >900 >90 >90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 >90 >90>90 >90 >90BamH ICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 >90 >9025 >90 >90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 >90 >90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 >90BstE IIGGGT(A/T)ACCC9010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 >90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 >90 500 0 >90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hind IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 >90 >900 >90 >90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco ICCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC8 10 12 18 20 220 0 0 0 75 750 0 0 0 >90 >90Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 >90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT12 2210 >90>90 >90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 >90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 >90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24 260 10 >90 >90 00 10 >90 >90 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA8 10 120 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG81010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 >90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT8 1210 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 120 0 10 >9010 10 50 >90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410 10 0 0>90 >90 50 50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 >90 75 750 >90 >90 >90Xho ICCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG8 10 120 10 100 25 75Xma ICCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA8 10 12 140 25 50 >900 75 >90 >902.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37进行同步酶切。但BamH I在37下有时表现出star活性，常用30单切。两个酶切位点相邻或没有共同 buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。 3.酶切底物DNA，切不开1）底物DNA上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。2）PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。3）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的DNA，同样量，用不同的限制酶切情况可能不同，由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA，不同的反应体系，酶切效果也可能不同，由于一些空间因素或不可测因素造成的。4）公司出售的限制酶都是液体状态，都是根据最佳反应体系配制了浓度，不可以再用buffer稀释，因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物DNA不能被切断的现象。不同公司的酶和buffer不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。5）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶，或将质粒DNA转入甲基化酶欠损的宿主菌中，重新制备DNA，也可以使用PCR的方法对DNA进行扩增，再做酶切。常用的有XbaI容易受甲基化影响，通常选用GM33做宿主菌转化。6）底物不纯，含有限制酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化DNA。一般做乙醇沉淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。 4.DNA经酶切后，电泳无带或出现smear现象DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase的作用，将DNA降解。可以用DNA上的其他酶，也可以用此酶切其他DNA来检查问题所在。
