各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看).doc
5页1、各种酶切位点的保护碱基酶不同,所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下,在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的,我们一般都随便加3个碱基做保护。寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。实验方法:用-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 g已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PA
2、GE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。酶寡核苷酸序列链长切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 90 900 90 90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 1290 90 9090 90 90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 90 9090 90 90BamH ICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 90 9025 90 90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 90 90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10
3、120 0 500 0 90BstE IIGGGT(A/T)ACCC9010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 90 500 0 90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 1290 90 9090 90 90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 1290 90 9090 90 90Hind IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 90 900 90 90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco ICCCATG
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