甲状腺疾病易感基因识别与鉴定

分 类号 密级 单 位 代码 学号 馨 了了 博士学 位论文 论文题目 习 杯哪碑孙局赓冬引 仍俨 ， 抖 七 琴官 尹 哺 作 者姓名 才扮 午 、 、厂 专业 指导教师姓名 专业技术职务 公动 一 乎 家 乞 尹巧年 弓月日 目 中文 摘要 英 文摘 要 符号说明 目 舀 录 ， 一 第 一 部 分病易 感基因的识别与鉴定 第 一 章定位克隆 法 筛 查病 易 感基因 材 料和方 法 ·· ··，·· ···，·······，·········，········· ··，·· ·，·，··························， ····，·】 一 结果 ·、·· ·· ·· ···· ········，······、，····· ，· ··，·、·········· ··········，······················，·· 一 讨论 ··、· · ·、，············ ····· ··，、···，·····，······， ·· ·，二·· ·，·············· 一 第二章对病相关基因功能 的初步探讨 材 料和方 法 ···· ··············· ········，····················，························· 一 ··········，····· 结果 ····、·······，·······，····················· ··· ··，·····， 一 ···············、·····，··············， 一 讨论 ······、·· ······ ···········，·············， ············， ··· ，· ·· ···，·· ····，· ·····，··· 参 考 文献 ··········· ······ ，·····，·········、···········，················，··············，···············，····· 一 第二部分受体基因与 、 和之间相关 性 的研 究 摘要 ，、······，·············································，····、·，·······，·············，·········· 对象与 方 法 ········，·， ···········，···············， ·····，······，、····、，· ······。····· ·······，· 一 ·· 一 结果 ··，······ 、·······，························ ·····，······························，·······，·······， 一 讨论 ·····································，······，······ ，···················，·············，·，· 一 参考文献 ···· ·····，·，·······，·····，··············，··················································，·· 一 全 文总结 ，······，、······，······，········，·······，······，·······，·······，····，·，······二······，·· ············ 附录 ···········，·，··············· ····· · ············，···············，···················，··········· 一 致谢 ····二······· ······，·· ····，·二············，·············· ·············，······························· 发表 文章 ·二 ········ “ ····························，···················、·················，···，、·······，·····，·· 一 山东大学博士学位论 文 摘要 甲状腺疾 病是一种临床 常 见病 ， 多发病 。 大致可分为自身免疫 性和非自身 免疫性甲状腺疾病 ， 迄今很多病种的病因病机尚未 阐明 。 己知其 中很多病种 如 有较强的遗传因素 存在 ， 是一种由多基因及 环境因素 共同作用 下发病的多基因遗 传 病 。 是否存在一个 或和几个主效基因目前 尚未肯定 。 其遗传 背 景复杂 ， 遗传易感 性可能由多个外 显 率 不同的基因所 决 定 ， 遗 传表现 型具有很大异质 性 ， 遗传模式与单基 因病不 同 ， 基本上不符 合孟德 尔遗 传规律另外 ， 环境等外 界因素 对疾病的发生和发展 起 着举足轻 重 的作用 。 识别和克隆甲状 腺 疾病 易感 基因是 一 项难 度大 、 意义也十分重 大 的课题 。 同时 ， 在目前 阶 段 ， 对 定位多基因复杂病 的研 究策略和分 析 方法本身就是一个 重 要 的研究课题 。 多基因病的遗传 易感性被认 为 是多个基因座 遗传变异 的累积效应 ， 每 个基因座对 表 型的影响较小 。 易感 性的这种遗传 方式是影响 多基因病 定位 的一个主要因 素 。 估计参与每一种 多基因病发病 的基因约有 一 个 ， 这些基因的及其特定的组 合单倍型可 能 是造 成 疾 病易感性最重 要 的原因 。 选择相对隔离 人群 ， 对疾 病相关调 节通路的候选基因或通过基因组定位 所限定的基因进 行的关 联分 析 ， 可能 是 多基因 病 发病 原理取得突 破 的希望所 在 。 随着现代 分子 生物学技 术的发展和人类基因组计 划 的实施 ， 人们对疾病的遗传 易感 性 有了更加 深入 的认识 ， 越来越多的候选基因被发现和识 别 。 甲状腺 疾病 相关 基因的研 究主要通过两种途径其一是候选 基因策略即与功 能有关的候选 基因与疾病关联性研 究 。 多选择和疾病病 理过程或信号传导通 路有关的免疫调节基因 ， 如 人白细胞抗原 ， 细胞 毒性细胞抗原 一 ， 促甲状腺激素受体 一 ， 甲状 腺过氧化物酶 ， 甲状腺球蛋 白 ， 钠碘同向转运体基因等作为候选基因其二是定 位 克隆策略即先通过脱氧 核糖核酸微卫星标 记进行 全 基因扫 描 ， 再在定位区 段进 行筛查 ， 识别并 鉴 定 该基因是 否为易感基 因 。 如定位于的基因年 等 、 定位于的 一 、 的 一 、 的 一 基因片 段 、 和 的细胞 受 体基因年等均是通过 定位克 隆策 略进行 的研究 。 但很 多结论仍 有争议 。 本研 究旨在 通 过上述两种策 略 对几种甲状 腺疾病的易 感基因进行探索 ， 包括 病 、 桥本氏甲状腺炎 、 结节性甲状腺肿 ， 识别和鉴定 这些疾 山东大学博士学位论文 病的致病基因 ， 希望能够在多 基因病 发 病 原理 的研究方面 取得突 破 。 本研究包括 两大部 分 一通 过定位 克隆 策略筛查易感 基因 。 最 近 ， 中国和日本通过 对 核心家系进行 全基因图谱扫描 ， 几乎同时将的易感 基因分别 定位于和 一 。 一 区 段可能是东亚人特有 的 与有 关的易感区段 。 该区段包含一簇可编 码细 胞因子的基因 如 工 、 儿 、 工 等 。 一 子宫球蛋白相关蛋白一基因是 从这个易感区 域 中筛 选 出来的一个 候 选 基因 。 一是甲状腺 特异转录因子一的下游靶基 因 ， 一可调 节 ， 等甲状 腺特异 基因的 表达几基因可通 过介导 免疫 炎症 反应 ， 参 与支气管哮喘 发 病的病理 过程 。 一基因 的特性提示 该基因可能 与 发 病有关 。 为了进一步研究二基因与之间的关系 ， 我 们收集了山东地区汉族 人中家系患者家族中有例以上 患者 ， 散发患者及健康对 照 作 为研究对 象 。 对且 基因的启 动子及外 显子序列 测序 ， 并进行住基因的单 核普酸多态位点及 其单 倍型与的关 联 分 析 。 应用对引物扩增 启 动子区及个外显 子区 ， 产物 纯 化 后 测序 ， 共 发 现个在 一 基因 的转 录起始位点到上游约一 的启动子区存在个在第三个外显 子第碱基存在一个第一内含子的第 碱 基 十 和碱基 工卜 的单 核营酸多态性 。 除一 己见报道外 ， 其 它位点 的均未见报道 。 对家 系 中的例患 者 、 例散发患者 、 例 健康对 照的 、 位点 的测序结果 进行分析 ， 经统计 学处理 ， 发现 、 二个位点有显 著 性差异 。 其后 ， 应用方法 进一步扩大了散发病 例例和健康对照 例的样本量对个位点进 行检测 ， 发现 、 共个 有 统 计 学差异 。 然后 又对几基因上 下游的个基因的进 行了筛查 ， 包 括 基因 、 基因 、 基因 、 基因 、 基因 、 基因 、 基因 ， 共筛查了个位 点 ， 得到个有效位点数据 。 发现个 、 种单 倍型有 统 计学 差异 。 最终将的 易感区段定位于约的狭小区段内 。 为了进一步明确该区段 内哪一个基因是的 易 感基因 ， 或 是两个以上基因协同作 用 ， 对相关 基因的功能进行了初步探 讨 应 用 瞬 时转 染 分析方法 ， 以荧光素酶 为报告 基因 ， 观察启动子的多态性对 一 基因转录 活性的 影 响用结合蛋 白的凝胶阻滞实验 ， 检 测 多态位点 的改变是否影响 尺 一 基因与转录因子和核抽提 物中其它转 录因子的结 合活性收 集甲状腺组织 山东大学博士学位论文 的标本 ， 提取 ， 进行该基因的多态位点分析 ， 鉴定其携 带 的单倍型 、 并用 和实时定量证实携带 一 基因不同单 倍型患者甲状 腺 组 织中 一 基因 的表达 是否有差异 。 了解且基因启 动子多态性变化对基因功 能的影响 ， 以验 证几基因与的 相关性是属于功 能性 的相 关还 是仅 为与该病相 关的遗传学标 记 物并做了基因在组织 中的表 达 谱 ， 以期明确哪 一个基因为致病的主效基因 或二者协同作用 。 荧光 素酶报告系统检 测的结果提示突变型 的且启动 子 活 性较野生型 活性 下 降两 个和两个以上 突变位点 有 协同作用 ， 统 计 学 差 异较 单个 位 点变化显著 。 有 增强吐基因启动子 功 能的作用实验提示 一 基因位点的改变 ， 增强 了与一附近序列 的结合力 ， 而减弱了与另 一未知转录因子 的结合 。 位点的改变 ， 减弱了与一附近序列的结 合力定量结 果 提示突变位点 导致了一在甲状腺 组织中表达水 平有降 低的趋 势 。 虽然己有初步 结果 ， 尚不 能完全 肯定 ， 还需 进 一步扩大样本 或 进 行重复验证 。 二通过候 选基因策略 ， 对争议颇大的热点 候选基因基因的变化 与病 、 桥本甲状腺炎和结 节性甲状 腺肿三 种甲状腺疾病 的相关 性进行 研究 ， 探 讨受 体与这三 种甲状 腺疾病有无相关性 。 以例有 明确甲状腺疾病家族 史患者 ， 包括例病 、 例桥本甲状 腺炎 、 例结节性甲状腺 肿患者 例散发患者及例健 康对照作为研 究对 象 ， 应用 外周全 血 抽提 ， 设 计引物 ， 扩 增 ， 对扩增产物 纯化后测序 ， 共发现个 多态位点 ， 其 中第外显 子 上 的多态位 点在库中未见报道 ， 为首次发现 。 将这 些多态位点基因 型变化经 与正常组对照 ， 无 明显统计 学差异 。 研 究提示汉族 人基因与 这 几种甲状 腺疾病无 相 关性该基因的 多态位点在 不