生物化学酶促反应动力学2
pH对酶活性的影响,1,温度对酶活性的影响,2,底物浓度对酶活性的影响,3,抑制剂对酶促反应速度的影响,4,Table of Contents,酶促反应的动力学实验,pH对酶活性的影响,实验原理 只有当酶蛋白处于一定的构象及电荷状态，才有利于酶和底物的结合和催化，使酶促反应最强，因此酶反应介质的pH可影响酶分子。在某一pH时，酶的催化活性达到最大值，该pH称为酶的最适pH。碱性磷酸酶的最适pH为812。 本实验采用磷酸苯二钠法，在不同的pH值的甘氨酸缓冲液条件下，测定其活性，从而确定其最适pH。 以磷酸苯二钠为底物，被碱性磷酸酶水解后则产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化可产生红色的醌类衍生物。根据红色深浅就可测出酶的活性，从而得出酶的最适pH。,反应式如下：,实验材料 甘氨酸缓冲液、0.04mol/L底物液、酶液、0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液、0.5%铁氰化钾液、酚标准液、 pH8.8Tris-乙酸缓冲液、碱液、0.3% 4-氨基安替比林液、0.04mol/L Na2HPO4,实验方法,1.取试管6支 ，编号，表操作,2.加入酶液后，立即计时，混匀后，在37水浴中准确保温5min。 3. 保温后，各管中立即加入碱性液1.0ml终止反应。 4.各管中分别加入0.3%4-氨基安替比林液1.0ml及0.5%铁氰化钾2.0ml充分混匀，使呈色完全。室温放置10min，以6号管为空白,不比色,用+来表示颜色的深浅.,温度对酶活性的影响,实验原理 温度对酶活性有显著的影响。温度低时，酶促反应减弱或停止，温度从较低逐渐升高时，反应速度也随之逐渐增加，当温度升高到某一定值时，酶促反应达到最高峰，此温度称为酶的最适温度。但酶是蛋白质，其本身也因温度升高而变性，超过最适温度时，其活性反而降低。一般温度升至80以上，酶活性几乎全部丧失。应指出，在进行体外实验时，酶的最适温度会随着保温时间长短而有所变化。 本实验以碱性磷酸酶为例，在一定时间，观察酶活性在不同温度下的变化。,实验步骤,1.取试管5支，编号，按表操作。,2.各管保温后，立即加入碱性试剂1.0ml以终止反应。 3.各管中分别加入0.3% 4-氨基安替比林液1.0ml及0.5%铁氰化钾2.0ml充分混匀，室温放置10min，以空白管校正零点，不比色,用+来表示颜色的深浅.,底物浓度对酶活性的影响 实验原理 1913年，Michaelis和Menten提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式，即米氏方程。 VVm×S / ( Km+S ) 式中： V为反应初速度 Vm为最大反应速度 S为底物浓度 Km为米氏常数 Km值是酶的一个特征性常数，可近似表示酶与底物的亲和力。 双倒数作图法是用实验方法测定Km值的最常用的方法。,双倒数作图法。,1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax,取米氏方程式的倒数形式：,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,-1/Km,米氏常数Km的测定,实验时选择不同的S，测定相对应的V。求出两者的倒数，以1/V对1/S作图，则得到一个斜率为Km/Vm的直线。将直线外推与横轴相交，其横轴截矩为：1/S1/ Km，由此求出Km值。该法比较简便。,本实验即以AKP为例，测定不同底物浓度对酶活性的影响，按双倒数方程式作图，计算出Km值。,实验方法,1.取干净试管10支，编号，按表操作（注：删除掉1、3、5、7试管）,底物浓度对酶活性影响实验的操作,各管充分混匀，放置十分钟，以第九管为对照，于波长510nm处比色，测定各管的吸光率，并计算出各管的酶活性。（注：9号试管为空白，10号为标准） 2.作图 （1） 以酶活性单位代表各管中该酶反应速度（V）为纵坐标，为以底物浓度（S)横坐标，在坐标纸上描出各点并连接之，观察该图形的形状。 （2）以酶活性单位的倒数代表该酶反应速度的倒数（1/V）为纵坐标，以底物浓度的倒数（1/S）为横坐标，在坐标纸上描出各点并连接之，求出该酶的Km。,抑制剂对酶促反应速度的影响,实验原理 能降低酶活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，被称为酶的抑制剂。酶的抑制分为可逆性与不可逆性抑制两大类。不可逆性抑制剂与酶生成共价结合的复合物，或以其他结合方式生成结合牢固且难于再解离的复合物。可逆性抑制剂如一般与酶的底物的化学结构相似的物质（竞争性抑制剂），可与酶的活性中心结合，从而使酶与其底物结合的比例减少，降低酶促反应速度，但当加大底物浓度时，可逆转其抑制。 本实验以无机磷酸盐及茶碱作为碱性磷酸酶的竞争性抑制剂进行实验，所得数据仍按双倒数方程作图，从而观察此类抑制的动力学特点。,实验方法,1.取干净试管10支，编号，按表操作（注：删除掉1、3、5、7试管）,充分混匀，室温放10min，以空白为对照，于波长510nm处比色，记录各管吸光率，并计算各管酶活性。 （注：9号试管为空白，10号为标准） 2.作图。 以代表酶活性单位的反应速度的倒数（1/V ）为纵坐标，以底物浓度的倒数（1/S)为横坐标，在坐标纸上画出相应的各点，并连接各点。观察直线在纵、横轴上的截距，求出其值，并与未加抑制剂时的值进行比较，说明该抑制剂属于何种类型的抑制剂。,注意事项,1.准确吸取各个试剂的体积，应特别注意准确吸取底物液、酶液及抑制剂。 2.保温时间务必准确，保温后应立即加入碱性试剂终止反应。 3.每个大组分成两个小组,一个小组做一和三实验,另一个小组做二和四实验. 4.三和四实验只做试管2 4 6 8 9 10.并注意最终底物(nmol/L)这一行不加任何试剂.九号试管为空白,十号试管为标准. 5.D液务必稀释10倍. 6.为了减轻学生负担，实验报告上表格可以直接写按教材P页表格进行操作。,
