酶工程 第五章 酶改性的基本理论——酶的结构及其与催化特性的关系 2013-2

1/138,酶工程 Enzyme Engineering,林范学 fanxuelingmail.com,1/501,2/138,第二篇 酶的改性,酶的改性（enzyme improving） ： 通过各种方法使酶的催化特性得以改进的技术过程 酶的改性的目的 提高酶的催化效率 增加酶的稳定性 降低或消除酶的抗原性 提高酶的使用效率（反复或连续使用酶） 扩大酶的使用范围（研究酶在水溶液以外的条件下进行催化反应的特性和条件） 酶的结构与功能的关系研究,3/138,常用的方法: 酶分子修饰（enzyme molecule modification） 酶分子定向进化（enzyme molecule directed evolution） 酶固定化（enzyme immobilization） 酶非水相催化（enzyme catalysis in non-aqueous phase）,第五章 酶改性的基本理论 酶的结构及其与催化特性的关系,第一节 酶的化学组成 第二节 酶的化学结构 第三节 酶的空间结构 第四节 酶的活性中心 第五节 酶的结构与催化特性的关系,5/138,第一节 酶的化学组成,6/138,一、蛋白类酶的基本组成单位氨基酸,氨基酸结构 肽键,7/138,8/138,9/138,二、核酸类酶的基本组成单位核苷酸,碱基+核糖+磷酸=核苷酸 3,5-磷酸二酯键,10/138,5AMP,5GMP,5UMP,5CMP,11/138,三、酶的辅因子,单成分酶：仅有蛋白质或核糖核酸组成的酶 双成分酶：除了蛋白质或核糖核酸外，还有其他非生物大分子成分的酶。,全酶 holoenzyme,无催化活性,有催化活性,决定专一性,传递电子、原子或某些化学基团,12/138,1. 无机辅因子,金属离子的作用： 参与催化反应 、稳定酶的构象。,13/138,无机辅助因子主要是指各种金属离子，尤其是各种二价金属离子。,（1）镁离子 镁离子是多种酶的辅助因子，在酶的催化中起重要作用。例如，各种激酶、柠檬酸裂合酶、异柠檬酸脱氢酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、各种自我剪接的核酸类酶等都需要镁离子作为辅助因子。,1. 无机辅因子,14/138,（2）锌离子 锌离子是各种金属蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶等的辅助因子，也是铜锌-超氧化物歧化酶（Cu，Zn-SOD）、碳酸酐酶、羧肽酶、醇脱氢酶、胶原酶等的辅助因子。,（3）铁离子 铁离子与卟啉环结合成铁卟啉，是过氧化物酶、过氧化氢酶、色氨酸双加氧酶、细胞色素B等的辅助因子。铁离子也是铁-超氧化物歧化酶（Fe-SOD）、固氮酶、黄嘌呤氧化酶、琥珀酸脱氢酶、脯氨酸羧化酶的辅助因子。,15/138,（4）铜离子 铜离子是铜锌-超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶、细胞色素氧化酶、赖氨酸氧化酶、酪氨酸酶等的辅助因子。,（5）锰离子 锰离子是锰-超氧化物歧化酶（MnSOD）、丙酮酸羧化酶、精氨酸酶等的辅助因子。,（6） 钙离子 钙离子是-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的辅助因子。,16/138,2. 有机辅因子,是指双成分酶中相对分子量较小的有机化合物。它们在酶催化过程中起着传递电子、原子或基团的作用。 (1)传递电子体：如 卟啉铁、铁硫簇； (2)传递氢（递氢体）：如FMN/FAD、NAD+/NADP+、CoQ、硫辛酸； (3)传递酰基体：如 CoA、TPP、硫辛酸； (4)传递一碳基团：如 四氢叶酸； (5)传递磷酸基：如 ATP，GTP； (6)其它作用： 转氨基，如 磷酸吡哆醛（VB6） ；传递CO2，如 生物素。,17/138,(1) 烟酰胺核苷酸(NAD+， NADP+) B族维生素 许多脱氢酶的辅因子：乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶 NAD+：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶I 一般与呼吸链相连，与分解反应偶联：（醇脱氢酶催化伯醇脱氢生成醛） RCH2CH2OH+NAD+=RCH2CHO+NADH+H+ NADP+：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶 。 一般与合成反应相偶联。,18/138,(2) 黄素核苷酸(FMN和FAD) 维生素B2(核黄素)的衍生物 各种黄素酶(氨基酸氧化酶、琥珀酸脱氢酶等)的辅助因子 FMN：黄素单核苷酸 FAD：黄素腺嘌呤二核苷酸 FMN和FAD的主要作用是传递氢。,19/138,(3)铁卟啉 铁卟啉是一些氧化酶（如过氧化氢酶、过氧化物酶等）的辅助因子。 它通过共价键与酶蛋白牢固结合 。 (4)硫辛酸 硫辛酸全称为6,8-二硫辛酸。它在氧化还原酶的催化作用中，通过氧化型和还原型的互相转变而起传递氢的作用 。 (5)核苷三磷酸(NTP) 腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(CTP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)等。它们是磷酸转移酶的辅助因子。,20/138,(6)鸟苷 鸟苷是含型IVS的自我剪接酶(R-酶)的辅助因子。 (7) 辅酶Q 辅酶Q是一系列苯醌衍生物 一些氧化还原酶的辅助因子。 (8) 谷胱甘肽(GSH) L-GluL-IleL-Gly三肽,21/138,(9) 辅酶A （CoA） 辅酶A是各种酰基化酶的辅酶，由一分子腺苷二磷酸、一分子泛酸和一分子巯基乙胺组成。 (10)生物素 生物素是维生素B的一种，又称维生素H 生物素是羧化酶的辅助因子，在酶催化反应中，起CO2的渗入作用。,22/138,(11) 硫胺素焦磷酸(TPP) 即维生素B1，是酮酸脱羧酶的辅助因子。 (12)磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺 即维生素B6，是各种转氨酶的辅助因子。 在酶催化氨基酸和酮酸的转氨过程中，维生素B6通过磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺的互相转变，起到氨基转移作用,23/138,第二节 酶的化学结构,一、酶蛋白的化学结构 即一级结构，是指蛋白质中的氨基酸按照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构。 氨基酸的种类和数目 氨基酸的排列次序 二硫键的数目和位置 肽链的数目等。 每种蛋白质都由唯一而确定的遗传信息决定氨基酸序列 一级结构决定蛋白质的高级结构,24/138,氨基酸：20种,AA的结构特点 -AA； 除Gly外都具有光学性(有D-和L-型两种光学异构体)。,结构通式:,25/138,-氨基酸,赖氨酸,26/138,L-型和D-型,丙氨酸,levorotatory dextrotatory,27/138,肽：一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物。 肽键（peptide bond）：一个氨基酸的-COOH 和相邻的另一个氨基酸-NH2脱水所形成的共价键。,28/138,29/138,肽单位：,CN，半双键性（partial double-bond character），不能旋转 CC、 N C，真正单键（pure single bond），可以旋转,30/138,二硫键 ：2个Cys的巯基脱氢联结而成,肽链内二硫键,肽链间二硫键,31/138,牛胰核糖核酸酶一级结构,32/138,胰凝乳蛋白酶 chymotrypsin,33/138,34/138,酶蛋白化学结构的测定,（1）酶蛋白的分离纯化（纯度97） 沉淀、离心、电泳、层析等等 （2）氨基酸种类和数目的确定 蛋白质水解后用层析技术等分离鉴定。氨基酸自动分析仪,35/138,（3）肽链数目的确定 通过末端分析等方法测定肽链的数目 通过还原法打开二硫键 在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。 （4）氨基酸顺序测定 酶蛋白不完全水解各种小肽末端分析综合分析,36/138,末端分析,二硝基氟苯（FDNB）法（N-末端分析）,37/138,肼解法（C-末端分析）,38/138,二、酶RNA的化学结构,酶RNA的化学结构主要包括组成RNA的核苷酸种类、数目和排列顺序。 4种核苷酸：AMP，GMP，CMP，UMP 3-5磷酸二酯键连接,39/138,酶RNA化学结构的测定 核酸自动测序仪,40/138,高通量测序（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation” sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS) 聚合酶克隆（Polony Sequencing） 454焦磷酸测序（454 pyrosequencing） Illumina (Solexa) sequencing ABI SOLiD sequencing 离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing） DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。,41/138,42/138,传统方法: (1)酶RNA的分离纯化，得到较纯的RNA样品 (2)将RNA水解成各种核苷酸，确定核苷酸的种类和数量 (3)用特异性酶切法或双脱氧终止法进行RNA序列测定,43/138,第三节 酶的空间结构,酶蛋白的空间结构：二、三、四级结构 酶RNA的空间结构：二、三级结构,44/138,一、酶蛋白的空间结构,包括二级结构、三级结构、四级结构 基本结构单位：螺旋、折叠、转角、卷曲等结构,45/138,1、酶蛋白的副键,（1）氢键: 肽键中羰基的氧原子等与亚氨基、羟基、氨基等基团中氢原子联结成的副价键 （2）盐键：蛋白质分子中氨基与羧基形成，结合力较强,46/138,（3）酯键：蛋白质分子中羧基与氨基酸上的羟基脱水而缩合而成 （4）二硫键：由蛋白质分子上两个半胱氨酸残基上巯基通过氧化脱氢而成，对蛋白质稳定性起重要作用,R1SSR2,47/138,（5）疏水键：蛋白质分子中疏水性较强的侧链基团聚集而成，对稳定蛋白有一定作用；,48/138,（6）范德华力：借助静电引力而形成，键能较小 （7）金属键：通过金属离子与蛋白质中基团联结而成，维持蛋白质空间构型有一定作用，在四级结构中联结亚基。,Copper chaperone protein PcoC,铜伴侣蛋白,49/138,2、酶蛋白的二级结构,主要指多肽键主链原子的局部空间排列，一般不考虑侧链的构象。 包括： -螺旋结构 -片层结构 -转角结构 无规卷曲,50/138,（1）-螺旋结构,-螺旋结构是由蛋白质的肽链环绕中心轴有规则一圈一圈盘旋而成。 右手螺旋（-helix）,螺距为0.54nm,含3.6个AA残基 两个AA之间的距离为0.15nm； AA残基侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间形成链内氢键； 主要靠氢键维持,51/138,-螺旋有左旋和右旋两种，右旋比左旋更加稳定，因此也更常见。,52/138,（2）-片层结构(pleated sheet),又称-折叠，是两条或多条肽链充分伸展成锯齿状的折叠结构，通过侧向聚集，形成与肽链长轴方向平行的折扇状构象。,肽链几乎完全伸展，通过链间的氢键交联维持结构； 肽链的主链呈锯齿状折叠构象，R基团处于折叠平面的两侧。,53/138,平行式,反平行式,54/138,（3）-转角结构（turn）,又称转弯或发卡结构，是在球蛋白中发现。,球状蛋白的多肽链经常出现180°的回折，这个回折角就是转角结构； 它由四个AA残基组成; 回折处的第一个AA残基的 -C=O 和第四个AA残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结。 -转角结构中常出现的AA有Gly、Pro、Asp、Asn、Trp等,55/138,56/138,（4）无规卷曲（nonregular coil）,又称自由回转（random coil)，是肽链的主链不规