工科硕士答辩-学术汇报PPT

xxx菌XX酶 基因工程菌的构建与发酵优化,硕士学位论文答辩,研 究 生:XXX 指导老师:xxx 教 授 xxx 副教授 xxx 副教授,碱性果胶酶 (PGL,E.C. 4.2.2.2),可在高pH条件下以反式消去作用断开果胶聚合物主链,裂解产物为4:5不饱和的寡聚半乳糖醛酸,碱性果胶酶概述,碱性果胶酯裂解酶主要来源于细菌和霉菌,其中细菌以Bacillus和Erwinia为主,纺织行业,不同来源的PGL分子量差别较大,范围为23-74kDa,最适pH 为8-11,其生化特性的差异可能是多种形式果胶存在的原因,其他领域,食品行业,纺织品前处理的酶法工艺流程, 生物法节能、水,低污染 提高产品质量, 环境污染和能源危机 纺织工业高污染、高能耗,碱性果胶酶概述,国内外碱性果胶酶基因工程菌研究情况,异源蛋白 分泌表达,目的蛋白 自身特性,过程 控制 策略,表达 系统 特性,诱导后流加策略 VS 异源蛋白分泌表达,重组大肠杆菌的分泌表达,重组大肠杆菌的分泌表达,研究思路,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,摇瓶水平,发酵罐水平,摇瓶水平,1. 碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究,3.2 流加培养过程诱导时机的研究,4. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达,5. 重组碱性果胶酶 粗酶性质的初步研究,原核宿主表达体系,菌体量,比生产,分泌比率,1. 碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达,Digestion and ligation,pgl 1.2 Kb,PGL基因PCR扩增片段鉴定,重组质粒酶切验证,1. 小结,发酵上清SDS-PAGE电泳分析, 将PGL-1638序列进行测序,得到Bacillus sp. WSHB04-02的PGL相关1638 bp的基因,将其CDS部分(1263 bp)在NCBI进行BALST分析,表明本研究克隆到的PGL基因与Bacillus subtilis SO113(NCBI Accession NO. X74880)的该基因同源性为98%,具有14个差别核苷酸., 将载体pET-20b(+)/pgl转化E. coli BL21(DE3),得到基因工程菌 E. coli BL21(DE3) (pET-20b(+)/pgl) ,且测序结果和SDS-PAGE结果证实了该表达载体中所插入基因编码的氨基酸序列完全正确 .,研究思路,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,摇瓶水平,发酵罐水平,摇瓶水平,1. 碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究,3.2 流加培养过程诱导时机的研究,4. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达,5. 重组碱性果胶酶 粗酶性质的初步研究,原核宿主表达体系,菌体生长,目的蛋白表达量,分泌比率,2.1 初始培养基的选择,采用在TB培养基作为发酵培养基,胞外PGL酶活到达28.75 U ml-1,分别是LB培养基的3.6倍和SB培养基的1.1倍.TB培养基和SB培养基中,比生产率(胞外酶活/DCW)和分泌率(胞外酶活/总酶活)基本相当,LB、2×YT和SOC培养基稍低 .,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,2.2 氮源对工程菌生长与产酶情况的影响,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,以安琪酵母粉和大豆蛋白胨为组合碳源,维持总氮量不变,考察不同配比对菌体生长与PGL合成的影响.确定氮源组成为:安琪酵母粉24 g L-1 、蛋白胨试剂11 g L-1.,Optimal carbon source :glycerol,Optimal optical concentration :10 g L-1,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,2.4 碳源对工程菌生长与产酶情况的影响,以甘油、葡萄糖为碳源时,菌体干重分别达到11.5 和13.1 g L-1,胞外酶活分别为28.1和 28.8 U ml-1,显著高于其他三种碳源. 但以葡萄糖为碳源时工程菌产酶不稳定.,10 g L-1甘油较适合菌体生长和PGL的胞外分泌,胞外PGL酶活与DCW分别为34.2 U mL-1 和13.6 g L-1. 继续增加甘油含量对菌体生长和PGL合成影响不明显.,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,2.3 金属离子对重组大肠杆菌生长与PGL合成的影响, 在接种同时加入Ca2+ 等微量金属元素(0.1 mM),对菌体生长造成明显影响,PGL产量也随之降低. 在OD=0.6时, 加入20 mM的Fe3+ 或Mg2+对PGL胞外积累具有促进作用,与对照相比分别提高15.4%和6.2%,但菌浓分别下降16.5%与19.7%., Ca2+的促进作用最为明显, 浓度升高作用越为显著,添加1mM、5mM和20mM ,PGL胞外酶活分别提升0.17%、13.5%和25.5%.,2.4 诱导条件重组PGL胞外生产的影响,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,PGL productivity was the highest at around 50 M of IPTG, 22 oC诱导时 ,PGL胞外酶活仅8.5 U ml-1,分泌率为47.7%,均为5者中最低. 30 oC时,细胞干重13.6 g L-1,分别是22 oC和26 oC 诱导的1.57倍和1.22倍. 然而,高生物量并没有带来高产量. 26 oC诱导达到蛋白合成与转运最佳平衡,胞外酶活65.8U ml-1,是 30 oC时的1.39倍,胞外分泌率达66.4%., IPTG对菌体生长有一定抑制作用,与对照相比,菌体干重下降约15%. 当IPTG浓度超过20 M,PGL总酶活反而降低. 添加50 M IPTG时,PGL总酶活最高,达到165.82 U mL-1,胞外分泌率76.8%.,Induction at 26 led to a better coordination between protein synthesis and translocation,IPTG添加浓度对PGL分布的影响, 随IPTG浓度由0升至400 M,相同生物量对应的不溶性包涵体逐渐增加. 其浓度为50 M时,可溶目的蛋白比例较高., 条带1,2,3 (cs):胞外组分 条带5,6,7 (si):胞内与周质可溶组分 条带8,9,10 (ii):胞内与周质不溶组分,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,为提高重组E. coli BL21(DE3)发酵生产碱性果胶酶的产量和胞外分泌率,在摇瓶中优化了重组大肠杆菌生产碱性果胶酶的关键因素,确定了其胞外表达的最适条件.发酵结束时菌体干重达11.8 g L-1,PGL 胞外酶活达165.8 U mL-1 ,胞外分泌率为76.8%. 最适培养基为:安琪酵母粉24 g L-1、蛋白胨试剂11 g L-1、甘油 10 g L-1、K2HPO4 72 mM、KH2PO4 17 mM. 最适诱导条件为:诱导温度为26 oC,添加0.05 mM IPTG诱导表达48 h. 在OD600=0.6时添加一定浓度Ca 2+、Fe 3+与 Mg 2+,对PGL的可溶表达具有促进作用.,2. 小结,研究思路,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,摇瓶水平,发酵罐水平,摇瓶水平,1. 碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究,3.2 流加培养过程诱导时机的研究,4. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达,5. 重组碱性果胶酶 粗酶性质的初步研究,原核宿主表达体系,菌体生长,目的蛋白表达量,分泌比率,3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究,指数流加策略,DCW () , glycerol feeding rate (), glycerol () ,acetate(),7.7 g L-1,13.9 g L-1, 指数流加9 h后甘油残留浓度达到13.9 g L-1. 诱导期乙酸积累量高达7.7 g L-1. 当其浓度高于2.0 g L-1时,会抑制细胞生长与重组蛋白的合成., 初始甘油浓度为10 g L-1 ,培养温度为37 oC. 当DO反弹甘油耗尽后, 进行指数流加, set=0.20 h-1. 当细胞干重达到15 g L-1,加入 0.05 mM IPTG,同时将培养温度降至26 oC,开始诱导PGL表达.,µset=0.2h1,46.2 g L-1,33.8 U mL-1, 菌浓大幅提升，指数流加9小时菌体干重攀升至46.2 g L-1. 但PGL胞外酶活在18处达到峰值,仅为33.8 U mL-1.,3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究,指数流加策略,DCW () , glycerol feeding rate (), glycerol () ,acetate(), 当诱导开始后,实际比生长速率(µexp) 明显低于设定比生长速率(µset).,若在诱导期采用低速流加以减缓营养物质的累积,可能有助于提高重组PGL的胞外产量., 30 h时细胞干重达到峰值41.3g L-1,比指数流加降低10.5%. 诱导期甘油与乙酸积累水平显著降低,分别维持在1.0 g L-1 和 0.7 g L-1以下.,DCW () , glycerol feeding rate (), glycerol () ,acetate(),3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究,两阶段流加策略,µset=0.2h1,12 ml h-1,43.1 g L-1, 诱导前(菌体生长阶段),指数流加,set=0.20 h-1. 当细胞干重达到15 g L-1,加入 0.05 mM IPTG,同时将培养温度降至26 oC,开始诱导PGL表达. 诱导后(PGL表达阶段) ,甘油流加速率为恒定的12 ml h-1., 高密度诱导时,菌体生长没有受到明显影响,最大细胞干重为44.6 g L-1 . 生长后期诱导虽然对菌体生长没有显著影响,但胞外产酶能力却为三者中最低,胞外酶活仅为93.72 U mL-1., 菌体干重、胞外酶活与胞内酶活分别为41.0 g L-1 、 257.8 U mL-1 和 114.1 U mL-1., 在中密度诱导时,PGL合成水平最高,总酶活在培养20 h至48 h的过程中大幅攀升,峰值为371.9U mL-1., 在细胞生长初期诱导,菌体生长受到明显抑制,发酵21h达到最高菌浓21.7 g L-1. 严重的生长抑制导致PGL合成水平大幅下降,发酵24小时胞外酶活为114.9U mL-1.,257.8 U mL-1,41.0 g L-1,3.2 流加培养过程诱导时机的研究,371.9 U mL-1,Biomass,Extracellular PGL,Total PGL,low cell density ( 7.5 g L-1),intermediate (15 g L-1), high ( 30 g L-1),针对指数流加过程中出现的,诱导后甘油残留、乙酸大量积累现象,采用甘油两阶段流加策略. 为进一步缓解诱导对微生物产生的负面作用,分别在重组菌生长的对数前期、中期与末期起始诱导,考察了不同诱导时机对重组大肠杆菌分泌表达PGL的影响. 诱导前(菌体生长阶段),控制温度为37 ,待甘油耗尽,开始指数流加甘油(set=0.2 h-1), 直到菌体干重达到15 g L-1;诱导后(PGL高表达阶段),将温度降低为26 ,同时