工科硕士答辩-学术汇报PPT
37页1、xxx菌XX酶 基因工程菌的构建与发酵优化,硕士学位论文答辩,研 究 生:XXX 指导老师:xxx 教 授 xxx 副教授 xxx 副教授,碱性果胶酶 (PGL,E.C. 4.2.2.2),可在高pH条件下以反式消去作用断开果胶聚合物主链,裂解产物为4:5不饱和的寡聚半乳糖醛酸,碱性果胶酶概述,碱性果胶酯裂解酶主要来源于细菌和霉菌,其中细菌以Bacillus和Erwinia为主,纺织行业,不同来源的PGL分子量差别较大,范围为23-74kDa,最适pH 为8-11,其生化特性的差异可能是多种形式果胶存在的原因,其他领域,食品行业,纺织品前处理的酶法工艺流程, 生物法节能、水,低污染 提高产品质量, 环境污染和能源危机 纺织工业高污染、高能耗,碱性果胶酶概述,国内外碱性果胶酶基因工程菌研究情况,异源蛋白 分泌表达,目的蛋白 自身特性,过程 控制 策略,表达 系统 特性,诱导后流加策略 VS 异源蛋白分泌表达,重组大肠杆菌的分泌表达,重组大肠杆菌的分泌表达,研究思路,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,摇瓶水平,发酵罐水平,摇瓶水平,1. 碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达,2. 影响重组大肠杆菌
2、胞外生产PGL的关键因素,3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究,3.2 流加培养过程诱导时机的研究,4. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达,5. 重组碱性果胶酶 粗酶性质的初步研究,原核宿主表达体系,菌体量,比生产,分泌比率,1. 碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达,Digestion and ligation,pgl 1.2 Kb,PGL基因PCR扩增片段鉴定,重组质粒酶切验证,1. 小结,发酵上清SDS-PAGE电泳分析, 将PGL-1638序列进行测序,得到Bacillus sp. WSHB04-02的PGL相关1638 bp的基因,将其CDS部分(1263 bp)在NCBI进行BALST分析,表明本研究克隆到的PGL基因与Bacillus subtilis SO113(NCBI Accession NO. X74880)的该基因同源性为98%,具有14个差别核苷酸., 将载体pET-20b(+)/pgl转化E. coli BL21(DE3),得到基因工程菌 E. coli BL21(DE3) (pET-20b(+)/pgl) ,且测序结果和SDS-PAGE结果证
3、实了该表达载体中所插入基因编码的氨基酸序列完全正确 .,研究思路,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,摇瓶水平,发酵罐水平,摇瓶水平,1. 碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,3.1 重组大肠杆菌两阶段甘油流加策略的研究,3.2 流加培养过程诱导时机的研究,4. 碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达,5. 重组碱性果胶酶 粗酶性质的初步研究,原核宿主表达体系,菌体生长,目的蛋白表达量,分泌比率,2.1 初始培养基的选择,采用在TB培养基作为发酵培养基,胞外PGL酶活到达28.75 U ml-1,分别是LB培养基的3.6倍和SB培养基的1.1倍.TB培养基和SB培养基中,比生产率(胞外酶活/DCW)和分泌率(胞外酶活/总酶活)基本相当,LB、2YT和SOC培养基稍低 .,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,2.2 氮源对工程菌生长与产酶情况的影响,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,以安琪酵母粉和大豆蛋白胨为组合碳源,维持总氮量不变,考察不同配比对菌体生长与PGL合成的影响.确定氮源组成为:安琪酵母粉24 g L-1 、蛋白
4、胨试剂11 g L-1.,Optimal carbon source :glycerol,Optimal optical concentration :10 g L-1,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,2.4 碳源对工程菌生长与产酶情况的影响,以甘油、葡萄糖为碳源时,菌体干重分别达到11.5 和13.1 g L-1,胞外酶活分别为28.1和 28.8 U ml-1,显著高于其他三种碳源. 但以葡萄糖为碳源时工程菌产酶不稳定.,10 g L-1甘油较适合菌体生长和PGL的胞外分泌,胞外PGL酶活与DCW分别为34.2 U mL-1 和13.6 g L-1. 继续增加甘油含量对菌体生长和PGL合成影响不明显.,2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素,2.3 金属离子对重组大肠杆菌生长与PGL合成的影响, 在接种同时加入Ca2+ 等微量金属元素(0.1 mM),对菌体生长造成明显影响,PGL产量也随之降低. 在OD=0.6时, 加入20 mM的Fe3+ 或Mg2+对PGL胞外积累具有促进作用,与对照相比分别提高15.4%和6.2%,但菌浓分别下降16.5%与19.7%
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