02微量凯氏定氮法测定蛋白质含量
实验二 微量凯氏（Mirco-Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量,一、实验目的,1.学习微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术 标准硫酸铵含量的测定 未知样品的消化、蒸馏和滴定 样品含氮量的计算等。,二、实验原理,凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质、核酸及氨基酸等）的含氮量。,二、实验原理,消化、蒸馏、吸收、滴定。 消化：天然的含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称之为“消化”。 （但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。）,蒸馏、吸收和滴定：浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定的量和浓度的硼酸溶液中（紫红色），硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低（绿色）。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止（紫红色），最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的含氮量。,二、实验原理,二、实验原理,蒸馏：(NH4)2SO4+2NaOHNa2SO4+2NH4OH NH4OHH2O+NH3 吸收：NH3+H3BO3 NH4H2BO3 滴定：NH4H2BO3+HCl NH4Cl+H3BO3,滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.25.6（pH5.2时呈紫红色，pH5.4时呈暗蓝色或灰色，pH5.6时呈绿色），将NH4H2BO3的绿色滴至紫红色即为终点。 本法适用范围为0.2-1.0 mg氮，相对误差小于±2%。,二、实验原理,三、实验器材和试剂,（一）器材 1、改良型凯氏定氮仪 2、10mL微量酸式滴定管 3、酒精灯（火柴或打火机） 4、凯氏烧瓶 5、锥形瓶（50-100mL）、容量瓶（50mL）,（二）试剂 1、0.1mg/mL 标准(NH4)2SO4溶液 2、30% NaOH溶液 3、2%硼酸 4、0.0100mol/L标准HCl溶液 5、混合指示剂,三、实验器材和试剂,四、操作步骤,1.样品的消化 将凯氏烧瓶做好标记后依次加入2粒玻璃珠、少量催化剂（硫酸钾-硫酸铜混合物）、2mL牛奶和5mL浓硫酸（加入物勿沾于瓶颈和瓶壁，勿振荡）； 置于电炉上进行消化； 彻底消化（现象？）后定容至25mL。,2.熟悉改良型凯氏定氮仪的构造,内室,外室,（1）取3-5个50mL锥形瓶，各准确加入5mL硼酸和1滴指示剂（呈淡紫色），表面皿覆盖备用。,3. 蒸馏器的清洗（将蒸汽发生器废水换掉，主要清洗反应室）,（2）打开8，排掉外室的废水，关闭8； 打开冷凝水，将7打开缓慢注入冷水，向外室中注入3/4球体的水，关闭7； 打开3，自加样漏斗向内室中加入7mL蒸馏水，关闭3，向加样漏斗中加少量蒸馏水作为水封； 酒精灯加热，待水沸腾1-2 min后，移开酒精灯，同时将7打开放入少许冷水（不得高于10），内室中的水会自动吸出； 关闭冷凝水，开闭8，调整外室水量，并使内室与外室温度相等。 反复清洗数次至干净。,（3）硼酸检测：将冷凝管出口下端浸入第1个盛硼酸及指示剂的锥形瓶的液面下，蒸馏1-2 min，观察颜色变化，若不变为鲜绿色，而是变为灰色或暗色，则表明反应室内部已洗净。 洗净后，先移开锥形瓶，再移开酒精灯，防止锥形瓶中液体被倒吸。,3. 蒸馏器的清洗,（1） 打开冷凝水，调整外室水量至球体3/4处； 将冷凝管出口下端浸入第2个盛硼酸及指示剂的锥形瓶的液面下； 打开3，向内室缓慢依次加入2mL 标准(NH4)2SO4溶液和5mL NaOH，关闭3，并在加样漏斗中加入少许蒸馏水做水封； 开始加热蒸馏（酒精灯火焰保持稳定）。,4. 蒸馏标准样品,（2） 当观察到锥形瓶内溶液由紫变绿时，开始计时蒸馏5 min，然后提高冷凝管出口离开液面1 cm高，同时用少许蒸馏水冲冷凝管出口外侧，继续蒸馏1 min。移走锥形瓶，用表面皿覆盖（等待滴定），撤掉酒精灯，关闭冷凝水。 （3）清洗反应室：同步骤3（2）。,4. 蒸馏标准样品,蒸馏过程中如发生倒吸现象，不得将锥形瓶移开，只要使冷凝管出口始终位于液面下即可。,用标准盐酸溶液滴定锥形瓶内溶液，当硼酸溶液刚由绿变为淡紫色时为滴定终点，记录所用盐酸的量。 滴定前检查滴定管是否洁净、是否漏液，滴定前使标准盐酸溶液处于0刻度或记录初始刻度。,5.滴定,（1）操作如蒸馏标准样品，空白不加(NH4)2SO4，而是2mL蒸馏水及5mL NaOH。 （2）第3个锥形瓶收集完后，清洗反应室，放掉废水，操作按照4（3）。,6.蒸馏空白（第二次实验）,7.蒸馏消化样品（第二次实验）,2mL样品+5mLNaOH，操作方法同标准样品。,8.计算,样品含N量（mg/mL）= C (V1-V2) ×14 / V,C 标准HCl的浓度（0.01mol/L） V1 滴定样品消耗标准HCl平均体积（mL） V2 滴定空白消耗标准HCl平均体积（mL） V 样品体积（2mL）,样品的蛋白质含量 （mg/mL）= 样品含N量× 6.25,本实验取牛奶2mL，消化后定容至25mL 结果表示：每100mL牛奶中的蛋白质含量（g）,五、思考题,分析本测定方法产生误差的可能原因。,预习实验,纸层析分离分析氨基酸,
