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02微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

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  • 上传时间:2019-04-20
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    • 1、实验二 微量凯氏(Mirco-Kjeldahl)定氮法测定蛋白质含量,一、实验目的,1.学习微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术 标准硫酸铵含量的测定 未知样品的消化、蒸馏和滴定 样品含氮量的计算等。,二、实验原理,凯氏定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量。,二、实验原理,消化、蒸馏、吸收、滴定。 消化:天然的含氮有机物与浓硫酸共热时,其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水,而氮则变成氨,并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称之为“消化”。 (但是,这个反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点,并加入硫酸铜作为催化剂,以促进反应的进行。),蒸馏、吸收和滴定:浓碱可使消化液中的硫酸铵分解,借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定的量和浓度的硼酸溶液中(紫红色),硼酸吸收氨后,氨与溶液中的氢离子结合,生成铵离子,使溶液中氢离子浓度降低(绿色)。然后用标准无机酸滴定,直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止(紫红色),最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的含氮量。,二、实验原理,二、实验原理,蒸馏:(

      2、NH4)2SO4+2NaOHNa2SO4+2NH4OH NH4OHH2O+NH3 吸收:NH3+H3BO3 NH4H2BO3 滴定:NH4H2BO3+HCl NH4Cl+H3BO3,滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂,其指示范围为pH5.25.6(pH5.2时呈紫红色,pH5.4时呈暗蓝色或灰色,pH5.6时呈绿色),将NH4H2BO3的绿色滴至紫红色即为终点。 本法适用范围为0.2-1.0 mg氮,相对误差小于2%。,二、实验原理,三、实验器材和试剂,(一)器材 1、改良型凯氏定氮仪 2、10mL微量酸式滴定管 3、酒精灯(火柴或打火机) 4、凯氏烧瓶 5、锥形瓶(50-100mL)、容量瓶(50mL),(二)试剂 1、0.1mg/mL 标准(NH4)2SO4溶液 2、30% NaOH溶液 3、2%硼酸 4、0.0100mol/L标准HCl溶液 5、混合指示剂,三、实验器材和试剂,四、操作步骤,1.样品的消化 将凯氏烧瓶做好标记后依次加入2粒玻璃珠、少量催化剂(硫酸钾-硫酸铜混合物)、2mL牛奶和5mL浓硫酸(加入物勿沾于瓶颈和瓶壁,勿振荡); 置于电炉上进行消化; 彻底消化(现象?)

      3、后定容至25mL。,2.熟悉改良型凯氏定氮仪的构造,内室,外室,(1)取3-5个50mL锥形瓶,各准确加入5mL硼酸和1滴指示剂(呈淡紫色),表面皿覆盖备用。,3. 蒸馏器的清洗(将蒸汽发生器废水换掉,主要清洗反应室),(2)打开8,排掉外室的废水,关闭8; 打开冷凝水,将7打开缓慢注入冷水,向外室中注入3/4球体的水,关闭7; 打开3,自加样漏斗向内室中加入7mL蒸馏水,关闭3,向加样漏斗中加少量蒸馏水作为水封; 酒精灯加热,待水沸腾1-2 min后,移开酒精灯,同时将7打开放入少许冷水(不得高于10),内室中的水会自动吸出; 关闭冷凝水,开闭8,调整外室水量,并使内室与外室温度相等。 反复清洗数次至干净。,(3)硼酸检测:将冷凝管出口下端浸入第1个盛硼酸及指示剂的锥形瓶的液面下,蒸馏1-2 min,观察颜色变化,若不变为鲜绿色,而是变为灰色或暗色,则表明反应室内部已洗净。 洗净后,先移开锥形瓶,再移开酒精灯,防止锥形瓶中液体被倒吸。,3. 蒸馏器的清洗,(1) 打开冷凝水,调整外室水量至球体3/4处; 将冷凝管出口下端浸入第2个盛硼酸及指示剂的锥形瓶的液面下; 打开3,向内室缓慢依

      4、次加入2mL 标准(NH4)2SO4溶液和5mL NaOH,关闭3,并在加样漏斗中加入少许蒸馏水做水封; 开始加热蒸馏(酒精灯火焰保持稳定)。,4. 蒸馏标准样品,(2) 当观察到锥形瓶内溶液由紫变绿时,开始计时蒸馏5 min,然后提高冷凝管出口离开液面1 cm高,同时用少许蒸馏水冲冷凝管出口外侧,继续蒸馏1 min。移走锥形瓶,用表面皿覆盖(等待滴定),撤掉酒精灯,关闭冷凝水。 (3)清洗反应室:同步骤3(2)。,4. 蒸馏标准样品,蒸馏过程中如发生倒吸现象,不得将锥形瓶移开,只要使冷凝管出口始终位于液面下即可。,用标准盐酸溶液滴定锥形瓶内溶液,当硼酸溶液刚由绿变为淡紫色时为滴定终点,记录所用盐酸的量。 滴定前检查滴定管是否洁净、是否漏液,滴定前使标准盐酸溶液处于0刻度或记录初始刻度。,5.滴定,(1)操作如蒸馏标准样品,空白不加(NH4)2SO4,而是2mL蒸馏水及5mL NaOH。 (2)第3个锥形瓶收集完后,清洗反应室,放掉废水,操作按照4(3)。,6.蒸馏空白(第二次实验),7.蒸馏消化样品(第二次实验),2mL样品+5mLNaOH,操作方法同标准样品。,8.计算,样品含N量(mg/mL)= C (V1-V2) 14 / V,C 标准HCl的浓度(0.01mol/L) V1 滴定样品消耗标准HCl平均体积(mL) V2 滴定空白消耗标准HCl平均体积(mL) V 样品体积(2mL),样品的蛋白质含量 (mg/mL)= 样品含N量 6.25,本实验取牛奶2mL,消化后定容至25mL 结果表示:每100mL牛奶中的蛋白质含量(g),五、思考题,分析本测定方法产生误差的可能原因。,预习实验,纸层析分离分析氨基酸,

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