02微量凯氏定氮法测定蛋白质含量
23页1、实验二 微量凯氏(Mirco-Kjeldahl)定氮法测定蛋白质含量,一、实验目的,1.学习微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术 标准硫酸铵含量的测定 未知样品的消化、蒸馏和滴定 样品含氮量的计算等。,二、实验原理,凯氏定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量。,二、实验原理,消化、蒸馏、吸收、滴定。 消化:天然的含氮有机物与浓硫酸共热时,其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水,而氮则变成氨,并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称之为“消化”。 (但是,这个反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点,并加入硫酸铜作为催化剂,以促进反应的进行。),蒸馏、吸收和滴定:浓碱可使消化液中的硫酸铵分解,借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定的量和浓度的硼酸溶液中(紫红色),硼酸吸收氨后,氨与溶液中的氢离子结合,生成铵离子,使溶液中氢离子浓度降低(绿色)。然后用标准无机酸滴定,直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止(紫红色),最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的含氮量。,二、实验原理,二、实验原理,蒸馏:(
2、NH4)2SO4+2NaOHNa2SO4+2NH4OH NH4OHH2O+NH3 吸收:NH3+H3BO3 NH4H2BO3 滴定:NH4H2BO3+HCl NH4Cl+H3BO3,滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂,其指示范围为pH5.25.6(pH5.2时呈紫红色,pH5.4时呈暗蓝色或灰色,pH5.6时呈绿色),将NH4H2BO3的绿色滴至紫红色即为终点。 本法适用范围为0.2-1.0 mg氮,相对误差小于2%。,二、实验原理,三、实验器材和试剂,(一)器材 1、改良型凯氏定氮仪 2、10mL微量酸式滴定管 3、酒精灯(火柴或打火机) 4、凯氏烧瓶 5、锥形瓶(50-100mL)、容量瓶(50mL),(二)试剂 1、0.1mg/mL 标准(NH4)2SO4溶液 2、30% NaOH溶液 3、2%硼酸 4、0.0100mol/L标准HCl溶液 5、混合指示剂,三、实验器材和试剂,四、操作步骤,1.样品的消化 将凯氏烧瓶做好标记后依次加入2粒玻璃珠、少量催化剂(硫酸钾-硫酸铜混合物)、2mL牛奶和5mL浓硫酸(加入物勿沾于瓶颈和瓶壁,勿振荡); 置于电炉上进行消化; 彻底消化(现象?)
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