细胞化学染色 (2)

第三章 血细胞化学染色,第一节 概述 以细胞形态学为基础，根据化学反应的原理，应用涂片染色的方法，对血细胞内的各种化学成分及其变化作定性、定位、半定量的分析。,一、研究对象 外周血和骨髓新鲜涂片单个细胞中的 化学物质： 酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等,二、基本步骤 固定 保持细胞结构和化学成分 显示 被染的化学物质最终形成稳定的 有色沉淀 复染 显示各种细胞，其颜色与有色沉 淀的颜色有明显的对比度,三、临床应用,1.鉴别各类血细胞 2.辅助血液系统等疾病诊断和鉴别诊断 3.观察疾病疗效和判断预后,第二节 常用细胞化学染色方法,过氧化物酶染色 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 过碘酸-雪夫反应 -醋酸萘酚酯酶染色 铁染色,一、过氧化物酶染色 （peroxidase，POX）,髓过氧化物酶（ marrow peroxidase,MPO ) 血细胞主要的POX,是人类中性粒细胞含量最多的蛋白质，主要功能是破坏生物氧化过程中有剧毒的过氧化物。,POX,新生态氧 O,过氧化氢 （基质中）,二氨基联苯胺 （无色）,粒、单核 细胞胞浆,【原理】,棕黄色沉淀 （浆内酶部位）,【结果判断】 阴性 无颗粒 弱阳性 颗粒小，分布稀疏 阳性 颗粒稍粗，分布较密集 强阳性 颗粒粗大，密布于整个胞浆,【正常血细胞染色反应】 1.粒细胞系统 POX主要存在于粒系细胞中。 分化差的原粒细胞阴性; 分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞各 阶段均呈阳性，阳性反应程度随细胞的成 熟逐渐增强。,2.单核细胞系统 阴性或弱阳性 3.淋巴细胞系统 红细胞系统 巨核细胞系统 阴性 浆细胞 组织细胞,【临床意义】,临床上是辅助判断急性白血病首选的、最重要的细胞化学染色 急性髓细胞白血病 急性淋巴细胞白血病,鉴别,1. 急性髓细胞白血病 （1）急性粒细胞白血病 阳性反应：M3M2bM2aM1 （分化差的原粒细胞呈阴性反应） （2）急性单核细胞白血病 弱阳性反应 （分化差的原单核细胞呈阴性反应）,2. 急性淋巴细胞白血病 阴性反应 或阳性率 3%(残留的原粒细胞),二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色,（neutrophilic alkaline,phosphatase，NAP）,磷酸萘酚钠 （基质中）,中性粒细胞胞浆中NAP,磷酸钠,-萘酚,重氮盐 （坚牢蓝盐RR）,紫黑色偶氮染料 （胞浆中）,水解,【原理】Kaplow偶氮偶联法,【结果判断】 胞浆中有紫黑色颗粒为阳性(+）,【正常血细胞染色反应】,1. 中性成熟粒细胞（杆状和分叶）阳性反应 其他细胞呈阴性反应,2.NAP积分值 油镜下计数100个成熟中性粒细胞（杆状和分叶）,分别记录其分级情况：,(-) 0分 (+) 1分 (+) 2分 (+) 3分 (+) 4分 阳性率 全部阳性反应细胞之和 积分值 各种阳性程度细胞的分值之和,3.参考值 积分值 4080分 阳性率 10%40% ( 各实验室参考值不同),【临床意义】 病理性变化： （1）细菌性感染与病毒性感染 （尤其是化脓性感染） 明显增加 无明显变化,(2）类白血病反应与慢性粒细胞白血病 明显增加 明显下降且常为零分， 缓解时又上升到正常,（3）再生障碍性贫血 增加 阵发性睡眠性血红蛋白尿 下降,三、过碘酸-雪夫反应 ( 糖原染色 ) （periodic acid-Schiff reaction，PAS）,双醛基,过碘酸,雪夫试剂中 的无色品红,紫红色化合物 (附于含多糖类 的胞浆内),乙二醇基 (多糖类物质含有),氧化,【原理】,【结果判断】,阳性 胞浆内出现红色阳性物， 呈弥漫均匀红色、颗粒状或小块状。 阴性 胞浆内无色,核淡绿。 用阳性率报告结果，并说明阳性物的形态。,【正常血细胞染色反应】,1.粒细胞系统 分化差的原粒细胞为阴性； 分化好的原粒细胞至中性分叶核粒细胞 各阶段均呈阳性反 应，阳性程度随细 胞的成熟逐渐增强。 阳性物呈细颗粒、 均匀红色。,2.红细胞系统 阴性 3.单核细胞系统 细颗粒状，有时分布于细胞边缘的阳性颗粒较粗大。,4.淋巴细胞系统 大多数淋巴细胞呈阴性； 少于20%淋巴细胞呈粗颗粒状或块状阳性。 5.巨核细胞系统 呈颗粒状或块状阳性（含血小板）。,【临床意义】,1.红细胞疾病:恶性疾病呈阳性，良性疾病，呈阴性。 红血病或红白血病 幼红细胞阳性 巨幼细胞性贫血 幼红细胞阴性 骨髓增生异常综合征 幼红细胞阳性 再生障碍性贫血 幼红细胞阴性,2.鉴别急性白血病类型,（1）急性淋巴细胞白血病 阳性率20%80%，呈红色粗颗粒状或块状。,（2）急性粒细胞白血病 少数阳性，呈细颗粒状或均匀红色。 （3）急性单核细胞白血病 可阳性，呈细颗粒状、弥散分布，有时 胞质边缘处颗粒较粗大。,（4）巨核细胞白血病 阳性或强阳性反应，表现为红色颗粒或块状。,3.其他细胞 戈谢细胞呈强阳性 （葡萄糖脑苷脂在单核-吞噬细胞积聚） 尼曼-匹克细胞呈阴性或弱阳性 （鞘磷脂在单核-吞噬细胞积聚）,四、-醋酸萘酚酯酶染色 （-naphthol acetate esterase，-NAE）,酸性-醋酸萘酚酯酶 （T淋巴细胞、单核-巨噬细胞） -醋酸萘酚酯酶（-NAE） 非特异性 （单核细胞、粒细胞、淋巴细胞） -丁酸萘酚酯酶 （单核细胞、巨噬细胞） 醋酸AS-D萘酚酯酶（AS-D NAE) （单核细胞、粒细胞、淋巴细胞） 特异性 氯乙酸AS-D萘酚酯酶(AS-D NCE) （粒细胞）,酯酶,-醋酸萘酚酯酶 （细胞内）,-醋酸萘酚 （基质液中）,-萘酚,重氮盐 （坚牢蓝B）,胞浆不溶性灰黑色 或棕黑色沉淀,水解,【原理】,【结果判断】 胞浆内有灰黑色或棕黑色弥散性颗粒状沉淀为阳性。,氟化钠抑制试验 在基质液中加入适量NaF,其余染色方法同上。 两种方法染色后用油镜计数100或200个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率或阳性积分。,氟化钠抑制率=,抑制前阳性率或阳性积分 - 抑制后阳性率或阳性积分,抑制前阳性率或阳性积分,100%,【正常血细胞染色反应】,1.单核细胞系统 原始单核细胞 分化差 阴性 分化好 阳性 幼稚及成熟单核细胞 阳性,被氟化钠抑制,2.粒细胞系统 原粒细胞阴性或弱阳性 以下阶段为弱阳性 3.淋巴细胞系统 多数阴性，少数弱阳性,不被氟化钠抑制,【临床意义】,急单 急粒 急性早幼粒 急粒单 急淋 -NAE +或 -或 + 阳性 -或+ + 弱+ NaF 被抑制 不被 不被抑制 部分被抑制 抑制 部分未被抑制,主要用于鉴别急性白血病类型,五、 -丁酸萘酚酯酶染色,2. 原理 细胞内的-丁酸萘酚酯酶(-NBE)在碱性条件下，将基质中的-丁酸萘酚水解，产生-萘酚，再与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于酶活性所在处。,-丁酸萘酚酯酶 （细胞内）,-丁酸萘酚酯 （基质液中）,-萘酚,重氮盐 （坚牢蓝B）,胞浆不溶性灰黑色 或棕黑色沉淀,水解,【原理】,参考值,粒细胞系统：各阶段均阴性 单核细胞系统：原单阴性，余均阳性，但被氟化钠抑制 淋巴细胞系统：B淋巴细胞均阴性，余可阳性 其他细胞：可阳性，不被氟化钠抑制,5. 临床意义： 1）鉴别急性白血病类型： AMOL时，原始单核细胞可呈阳性反应，幼单核细胞和成熟单核细胞呈强阳性反应，但能被氟化钠抑制(抑制率在50%以上)；AML时，原始粒细胞一般呈阴性反应，少数呈阳性反应，但不被氟化钠抑制或仅部分轻度抑制；ALL时，原始淋巴细胞和幼淋巴细胞呈阴性反应，T-ALL原始淋巴细胞可呈阳性反应，但不被氟化钠抑制。 2）鉴别急性单核细胞白血病和组织细胞白血病：异常组织细胞可呈阳性反应，但此酶不能被氟化钠抑制；急单时，白血病细胞的阳性反应可被氟化钠抑制。,六、铁 染 色 （ferric stain）,正常人骨髓中的贮存铁存在的方式： 骨髓小粒中的含Fe血黄素 骨髓单核-巨噬细胞内 （细胞外铁） 铁蛋白 幼红细胞内（细胞内铁）,亚铁氰化钾,亚铁氰化铁 (蓝色沉淀在含Fe部位),铁,酸性环境,普鲁士蓝 反应,原理,【结果判断】 细胞外铁 低倍镜观察涂片尾部和骨髓小粒,细 胞外铁位于幼红细胞外或骨髓小粒巨噬 细胞浆内，呈蓝色颗粒状、小珠状或团 块状。,再用油镜判断阳性程度，根据铁量 多少分五级: （-） （+） （+） （+） （+）,细胞内铁 幼红细胞核染色为鲜红色,铁粒呈蓝绿色。 油镜下计数100个中幼红细胞和晚幼红细胞，记录胞浆中含有蓝色颗粒细胞的百分率。,根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况,将铁粒幼红细胞分为四型: 型(1-2) 型(3-5) 型(6-10) 型(11以上),铁粒幼红细胞 胞质中出现蓝色铁颗粒 的幼红细胞。 环铁粒幼红细胞 幼红细胞胞质内蓝色铁 颗粒在6颗以上，并围绕 核周1/2以上者。 铁粒红细胞 成熟红细胞出现蓝色铁颗 粒。,1.细胞外铁 +，约2/3人为+，约1/3人为+。 2.细胞内铁 阳性率19%44% 型为主，少数为型（无环形铁粒幼红细胞和铁粒红细胞）,【参考值】,【临床意义】 1.诊断缺铁性贫血、指导铁剂治疗 细胞内、外铁明显减低甚至消失，经铁剂 治疗有效后，其细胞外铁、内铁先后增多。,2.诊断铁粒幼细胞性贫血 铁粒幼红细胞、环形铁粒幼红细胞均增多，细胞外铁也常明显增多。 (与血红素合成有关的酶和辅酶缺乏或活性降低 铁利用障碍、血红素合成障碍、红细胞无效生成）,3.骨髓增生异常综合征（MDS） 伴环形铁粒幼红细胞增多的难治性贫血（RARS亚型），其环形铁粒幼红细胞大于0.15。,正常骨髓细胞各染色结果对比表,染色方法 红系 粒系 单核系 淋巴系 巨核系 POX 阴性 阳性 弱阳性 阴性 阴性 NAP 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 PAS 阴性 阳性 阳性 阴性/阳性 阳性 NAS-DCE 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 -NBE 可阳性 阴性 阳性 可阳性 可阳性 POX:粒细胞，单核细胞 NAP:杆状核、分叶核 NAS-DCE：粒细胞，单核细胞 -NBE ：单核细胞 PAS:除红细胞系统外，均可,常用的细胞化学种类和意义,1掌握常用细胞化学染色方法的结果判断和临床意义。 2熟悉常用细胞化学染色方法的原理。,本章目的要求,