国家自然基金标书-常见肾小球疾病发病机制及其早期诊断

项目名称：常见肾小球疾病发病机制及其早期诊断首席科学家：刘志红 中国人民解放军南京军区南京总医院起止年限：2012.1-2016.8依托部门：总后勤部卫生部 江苏省科技厅一、关键科学问题及研究内容（一）本项目将集中解决如下关键科学问题：1. 肾小球早期损伤的细胞学基础和分子机制及其干预措施2. 肾小球疾病发生的遗传学背景及环境表观遗传学调控机制3. 肾小球疾病早期诊断生物标志物的发现及验证其学术内涵包括：1. 肾小球早期损伤的细胞学基础和分子机制及其干预措施（1）足细胞损伤及与其他肾小球固有细胞和肾小管上皮细胞损伤间相互作用的分子机制尚不明确蛋白尿的防治一直是肾小球疾病研究的重点内容，足细胞损伤又是蛋白尿成因的关键所在，研究发现，免疫、炎症、感染（病毒和细菌）、毒物、药物、代谢紊乱及血流动力学异常等多种因素均能直接或间接地导致足细胞损伤。足细胞成熟表型的维持是其行使正常生理功能的结构基础。病理条件下，足细胞出现极性丢失、表型改变是造成肾小球滤过屏障损坏的一个重要机制。始于足细胞的损伤，可介导肾小球血管内皮细胞及系膜细胞的活化，导致肾小管上皮细胞的损伤，进而引起肾小球硬化和肾脏纤维化。然而目前对造成足细胞表型改变的因素及机理尚不清楚，对足细胞、内皮细胞及系膜细胞相互作用机制缺乏研究，对足细胞损伤介导肾小管上皮细胞损伤的作用及机制尚不明确，这些问题亟需深入研究。（2）缺乏针对足细胞损伤机制的干预措施足细胞损伤机制的阐明为以足细胞为导向的干预治疗奠定了基础，也使研发和应用这类药物成为可能。保护足细胞损伤可阻滞蛋白尿的发生、减轻肾组织病变、改善症状、延缓肾脏疾病的进展。在前期工作中，我们发现氧化应激、Wnt/-catenin信号通路、mTOR信号通路和线粒体功能障碍在足细胞早期损伤过程中发挥了重要作用。本研究将通过建立不同的足细胞损伤动物模型和特殊的足细胞系，研究硝基化脂肪酸、雷公藤甲素和纠正线粒体功能异常对足细胞损伤的干预作用及其机制，对探索新型足细胞损伤干预靶点及有效治疗措施；推进足细胞保护药物的临床应用具有重要意义。（3）miRNA在肾小球损伤中作用机制的研究刚刚起步miRNA在各种生命活动中发挥着非常重要的作用。我们的既往研究结果表明分泌型miRNA存在于患者血、尿中，不仅可作为疾病的诊断标志物，还可作为一类全新的信号因子，介导细胞间及组织、器官和系统间的信号传递，参与肾小球疾病的发生发展过程。但目前对于分泌型miRNA在肾小球损伤和肾脏疾病发病中的作用机制尚不明确。本研究将由既往研究中在肾小球肾炎（如FSGS和IgA肾病）患者肾组织、血浆和尿液中发现的异常表达的分泌型miRNA出发；进一步确定其靶基因和调节网络；阐明分泌型miRNA介导足细胞和肾小管上皮细胞损伤及导致肾小球疾病发生发展的分子机制；发现和检验肾小球肾炎早期临床诊断的分泌型miRNA谱，探索其作为疾病早期诊断标志物的价值。2. 肾小球疾病发生的遗传学背景及环境表观遗传学调控机制（1） 我国家族性、散发性FSGS的遗传背景缺乏深入研究肾小球肾炎尤其是FSGS具有明显的遗传特征。近年来国外对FSGS的遗传背景进行了多项研究，然而我国对这方面的研究尚属空白。我国家族性、散发性FSGS具有何种遗传背景？足细胞相关蛋白的基因突变是否是引起我国FSGS的关键因素？上述问题均有待深入研究。我们将对我国FSGS患者的遗传背景进行系统研究，以期发现我国FSGS的遗传特征和基因缺陷，从而揭示遗传背景在FSGS致病中的作用和机制，提高FSGS的早期诊断和治疗水平。（2）环境-基因-表型相互作用的表观遗传学调控在肾脏疾病发病中的机制研究尚属空白表观遗传学调控反映了环境-基因-表型的相互作用，在很多疾病的发生中发挥重要作用，但在肾脏疾病发病中的作用缺乏深入研究。尤其是随着我国经济飞速发展和居住条件的改善，由非环保建材和室内装饰材料所引发的病态建筑物综合症（sick building syndrome, SBS）或病态居室综合症（sick house syndrome, SHS）的发病率明显增高，人们开始关注室内环境因素（indoor environment）在人类疾病中的作用。本项目将通过深入研究肾小球疾病发病中的表观遗传学调控机制，重点揭示有机溶剂导致的表观遗传修饰在肾小球疾病发病中的作用，阐明环境和基因易感性之间的相互作用，为这类疾病的诊治奠定理论基础。3. 肾小球疾病早期诊断生物标志物的发现及验证肾脏疾病缺乏非创伤性、早期诊断手段。肾穿刺活检病理不仅是一种有创性诊断手段，而且无法动态地对疾病进行观察。目前，尚无非侵入性的诊断方法能够取代肾活检这一肾病诊断的标准方法。因此，探寻合适的非侵入性肾病诊断方法一直是肾脏疾病研究领域中最紧迫的课题之一。本项目将借助系统生物学的组学方法，利用我国大样本肾脏病生物标本库（肾组织、血液、尿液等），以基础研究结果为线索，发现肾小球疾病早期诊断标志物，并在临床上进行验证和应用，提高我国肾脏病的早期诊断治疗水平。（二）主要研究内容本项目以常见肾小球疾病为主要研究对象，以足细胞损伤为中心轴，利用细胞、基因敲除小鼠、疾病动物模型和患者标本，将“组”学研究与“金标准”检测相结合，应用全基因组外显子组测序、功能基因组学、表观遗传组组学、蛋白质组学等研究手段，开展多层次、全方位研究，从整体和宏观角度系统阐明足细胞损伤及其导致肾小球疾病发生发展的机制；同时在患者样本（组织、血液、尿液等）中进一步验证。具体研究内容包括：1、 足细胞在肾小球损伤中的作用机制研究：病理条件下，足细胞出现极性丢失、表型改变是造成肾小球滤过屏障破坏和肾小球损伤的一个重要机制，始于足细胞的损伤可造成肾小球血管内皮细胞及系膜细胞活化、介导肾小管上皮细胞损伤，加速肾脏疾病进展。本项目将研究Wnt、-catenin信号转导等足细胞活化及表型改变的分子调控机制；探索足细胞活化对肾小球内皮细胞和系膜细胞的损伤的影响和机制；研究足细胞损伤导致肾小管损伤的机制，进一步的明确肾小球疾病的病理生理机制，并在此基础上寻找新型肾小球和肾小管损伤的诊断标志物。2、 足细胞损伤干预药物的分子机制研究：在明确足细胞在肾小球损伤中的作用的基础上，本项目将开展硝基化脂肪酸对足细胞的保护作用及其与核受体过氧化物体增殖物激活受体（PPAR）的关系的研究；探索雷公藤甲素对足细胞的保护作用及其分子机制；进行线粒体功能障碍在肾小球足细胞早期损伤中的作用及干预研究，在进一步明确足细胞损伤机制的基础上为肾小球疾病提供新的治疗靶点，为硝基化脂肪酸、雷公藤甲素和PGC-1a或PGC-1a激动剂白藜芦醇的临床应用提供更多的理论依据。3、 miRNA导致肾小球损伤的机制研究：本课题组成员首次提出分泌型miRNA这一概念，并证实其作为全新信号分子的功能（Zhang et al, Mol Cell, 2010,39:133）。分泌型miRNA主要来源于巨噬细胞，研究分泌型miRNA在肾小球损伤中的作用有助于揭示循环中miRNA导致肾损伤的机制。本项目组将在对肾小球肾炎患者的肾组织、血液、尿液miRNA表达谱分析中所发现的分泌型miRNA 表达的基础上，确定关键分泌型miRNA的类型和来源，确定其靶基因和调控网络，并证实靶基因调节网络和生物学通路；利用足细胞和肾小管上皮细胞损伤的体外及动物实验模型以及miRNA靶基因敲除/过表达动物模型，进一步研究分泌型miRNA产生和调控的机制、对应的靶基因在肾小球疾病发生发展中的作用机制，阐明分泌型miRNA介导足细胞损伤和肾小管损伤的分子机制及其在肾小球疾病发生发展中的作用，为肾小球肾炎的治疗提供新的重要分子靶标。4、 肾小球损伤的遗传学和表观遗传学研究：遗传背景和表观遗传修饰是导致肾小球疾病的重要因素。为进一步明确肾小球疾病的遗传背景，我们将利用全基因组关联分析（GWAS）研究散发性FSGS相关基因；同时利用连锁分析、全基因外显子组测序等方法对家族性FSGS患者致病基因进行研究，我们还将利用基因敲除动物模型等研究手段，对发现的致病突变进行体内外功能研究，从生物学角度阐明基因变异导致肾小球疾病的病理生理机制。我们已建立一种基于McrBC酶切和自定义微列陈芯片的DNA甲基化高通量分析方法(comprehensive high-throughput arrays for relative methylation, CHARM，Irizarry et al, Nat Genet, 2009,41:178）。我们拟用CHARM方法，对来自特发性FSGS患者肾组织进行全基因组DNA甲基化分析，在全基因组水平鉴定出具有统计学意义的差异甲基化区域（differential methylation region, DMR）；并进行验证和分子机制研究；我们还将用DNA甲基化高通量分析方法对临床有机溶剂肾损伤患者肾组织及苯、甲醛、氯乙烯等有机溶剂诱导培养的足细胞和由有机溶剂损伤大鼠模型肾小球分离的足细胞，进行全基因组甲基化分析，并进行功能研究，以揭示有机溶剂通过影响足细胞关键基因的甲基化状态导致足细胞损伤的机制；我们还将应用高通量的染色质免疫沉淀的microarray 芯片分析（ChIP-chip）方法，对有机溶剂诱导培养的足细胞进行全基因组H3K4和H3K9甲基化分析，鉴定出组蛋白修饰异常基因，揭示有机溶剂影响组蛋白修饰导致足细胞损伤的分子机制；以肾脏UB 细胞为模型，研究LPS刺激后NGAL高表达的调控机制，阐明肾脏细胞在LPS刺激下NGAL高表达的表观遗传学调控机制。上述研究对进一步阐明环境诱导肾小球病变的表观遗传学机制具有重要意义，并为肾脏损伤和修复研究提供新思路。5、 肾小球疾病早期诊断标志物的发现及验证：针对目前临床中缺乏新型、无创性肾小球疾病早期诊断标志物的现状，本项目组将在上述课题研究结果的基础上，充分利用本项目拥有的国内最大规模肾脏疾病患者生物标本库开展转化型研究，筛选和验证新型肾小球疾病早期诊断标志物。本项目组将挑选出经肾活检诊断明确的不同阶段FSGS、IgAN和LN患者，提取其肾组织活检标本进行转录组学、蛋白质组学和miRNA组学分析，以正常肾脏组织作为对照，筛选出同肾组织早期病理形态学改变相关的mRNA、蛋白质和miRNA，作为肾小球疾病早期诊断候选生物标志物；同时我们还将开展尿液来源的肾小球疾病早期诊断标志物的组学筛查，结合分泌型miRNA研究结果，利用经肾组织活检诊断明确的不同阶段FSGS、IgAN和LN患者的尿液蛋白质组学和miRNA检测结果，以正常人尿液为对照，筛选出同肾组织早期病理形态学改变相关的尿液蛋白质和分泌型miRNA，作为肾小球疾病早期诊断候选生物标志物；在此基础上，我们将进一步扩大样本量，选取诊断明确的FSGS、IgAN和LN患者，提取其肾组织和尿液标本，针对性检测上述工作获得的肾小球疾病早期诊断“候选生物标志物”，验证其同肾组织早期病理形态学改变的相关性，筛选出可用于临床的早期诊断标志物。继而进行多中心前瞻性临床研究，选取不同临床表现的肾小球疾病患者，留取肾组织活检标本和尿液，利用筛选出的早期诊断标志物进行分子诊断，将结果与肾小球病理诊断和损伤进程进行关联分析，从而确定灵敏度高和重复性好的肾小球疾病早期诊断标志物，在临床进行推广应用。二、预期目标（一）本项目的总体目标本项目针对国家人口战略重大需求，着眼解决肾脏疾病这一我国常见慢性疾病所面临的重大科学问题而设立。围绕关键科学问题，以我国常见肾小球疾病为研究对象，以足细胞损伤为中心轴，分别从足细胞损伤的关键信号通路及其与肾小球固有细胞和肾小管损伤的相互作用、肾小球损伤的遗传背景和环境表观遗传学机制等多个角度进行全方位的研究，阐明足细胞损伤及其导致肾小球疾病发生发展的机制；将宏观与微观相结合、基础和临床相转化，