QIAGEN DNA甲基化试剂盒说明中文版

QIAGEN EpiTect® Bisulfite二IBisulfite reactionDNA and EpiTect reaction buffersWashDesulfonationWash (x 2)Load Spin ColumnAdd Buffer BWAdd Buffer BDAdd Buffer BWDNA conversion in thermal cycler (5 h)Transfer to 1.5 ml microtube Add Buffer BLEpiTect Bisulfite Conversion Procedure 重亚硫酸盐处理 DNA 时， 需要经高盐浓度、高温和低 PH 条件，会导致 DNA 断裂和片段 化，并在随后的纯化过程中丢 失，所以需要大量的 input DNA 重亚硫酸盐转化未甲基化 的胞嘧啶，转化率超过 99% Bisulfite Mix 足够做 8 个 反应，用时要将 Bisulfite Mix 溶于 800山 RNase-free water 中， 溶解的 Bisulfite Mix 在-20°C可 以保存4周 DNA Protect Buffer 能保 护重亚硫酸盐处理的DNA在高 温、低ph条件下被片段化 Carrier RNA 能提高小量 DNA （小于500pg，体积大于 40山）绑定在回收柱滤膜上的 效率，帮助核酸沉淀；总量大 于100ng的基因组DNA没有必 要加 Carrier RNA EpiTect Bisulfite Kit 在-20C 可以保存 3 年；可以适用于大 范围的DNA量，input DNA范 围为1ng2yg；模板DNA片段 范围可以在500bp30kb之间ProtocolDNA量在1ng2pg之间，体积20山以上开始前的准备重点： Bisulfite Mix 足够做 8 个反应，如果样本少于 8 个，可以把溶解的 Bisulfite Mix 保存于 -20°C, 4周内并不会影响其性能 DNA Protect Buffer在加入DNA-Bisulfite Mix后会由绿变蓝（step 2）,表明溶液混合很充 分且PH值正确 所有的离心分离步骤均在室温（15-25°C）下完成开始前准备的东西： 加入30ml乙醇（96%100%）到Buffer BW中，室温（15-25°C）保存，使用之前摇匀 加入27ml乙醇（96%100%）到Buffer BD中，28C保存，使用之前摇匀，使用之后要 立即盖上盖子。储存一段时间后底部可能会出现白色沉淀，沉淀不影响 Buffer BD 的性 能，但是还是要避免将沉淀吸到回收柱中。 加入310山RNase-free water到冻干的carrier RNA （310 |ig）中，配成1愿/山的溶液。当 一次处理48个样本，将溶解的carrier RNA加入到Buffer BL的瓶子中，摇匀并确认瓶盖 标签。如果处理的样本较少，则将溶解的carrier RNA分装，并储存于-20C,分装的carrier RNA 能保存 1 年。如果少于 48 个样本要在2 周之内完成处理，则参照表 1 的体积比取 一定体积的Buffer BL与carrier RNA混合。DNA量大于100ng不需要加carrier RNA。如 果Buffer BL有沉淀，则需加热（最高不超过70C ）并温和搅拌使其溶解。表 1 Buffer BL 与 carrier RNA 的体积比Number of samples48162448Volume ofBuffer BL*620 jul2.5 ml5 ml10 ml1 5 ml31 mlVolume of6.2 fj25创50灿100/ul150 pl310glcarrier RNAsolution* The volumes given contain 1 D% surplus for pipetting inaccuracies.1 Resulting in a final conceniration of 1 0 pg/ml carrier RNA in Buffer BL. 室温平衡样本和 Buffers实验流程重亚硫酸盐转化 DNA1. 融化DNA备用，溶解Bisulfite Mix,加入800山RNase-free water,混匀5min使其完全溶 解。如有必要，60°C加热并混匀Bisulfite Mix-RNase-free water溶液使其溶解。注意不要 将溶解的 Bisulfite Mix 置于冰上。2. 在200山离心管中配制重亚硫酸盐转化反应液，参照表2配制反应体系，DNA体积不足 20山则用RNase-free water补足。（处理低浓度DNA（1500ng或小于500pg）时，DNA 体积增加到40山，DNA Protect Buffer减少为15山，总体积140山不变）表 2 重亚硫酸盐转化反应体系ComponentVolume per reaction (pl)DNA solution (1 ng - 2 /g)Variable* (maximum 70 戏 1RNase-free waterVariable*Bisulfite Mix (dissolved), see step 185DNA Protect Buffer35Total volume140A I he combined volume ot DNA solution and RNase-free water must tDtal 20 pl.3.盖上PCR管盖，混匀反应液，置于室温(15-25°C)°DNA Protect Buffer在加入DNA-BisulfiteMix后会由绿变蓝，表明混匀充分且PH值正确。4.在循环加热器上进行重亚硫酸盐转化DNA反应，反应条件参照表3。整个反应过程需要 5h。表 3 重亚硫酸盐转化反应条件StepTimeTemperatureDenaturation5 min95°CIncubation25 rriin60°CDenaturation5 min95Incubaiion85 min (1 h 25 min)609Denaturation5 min95&Clncubai?on1 75 min (2 h 55 min)HoldIndefinite20"CT Converted DNA can be left in ihe thermal cycler overnight without ary loss of performance.5.将PCR管放入循环加热器中，开始转化反应。注意PCR管中不要加入矿物油，保证管盖密封。已经转化的DNA可以在循环加热器中保存过夜，不会影响其性能。纯化重亚硫酸盐转化的 DNA6. 待转化反应完成之后，取出 PCR 管，瞬时离心，再将 PCR 管中的反应液转到一个 1.5ml 的干净的离心管中。转移反应液不影响其性能。7. 在每个样本中加入560山现配的Buffer BL （参照表1加入10yg/ml carrier RNA）,涡流混 匀并瞬时离心。如果DNA大于100ng,则不需要加入carrier RNA。（处理FFPE样本或 DNA量小于500pg的样本时，加入现配的Buffer BL的体积减少为310山（加入10yg/ml carrier RNA），混匀离心，之后再加入250山96T00%乙醇，混匀15s后瞬时离心）8. 将收集管和回收柱按样本编号并放置在架子上，将1.5ml离心管中的样本混合液全部转 移到相应的回收柱内。9. 以离心机最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。10. 在每个回收柱内加入500山Buffer BW （wash buffer），用最大转速离心1min，弃收集管 内的液体，再将回收柱放回收集管中。11. 在每个回收柱内加入500山Buffer BD （desulfonation buffer，脱磺酸基），盖上回收柱盖 子，室温（15-25°C）放置15min。如果Buffer BD中有沉淀，避免将沉淀加到回收柱内。 装有Buffer BD的瓶子在使用后要立即盖上盖子，避免接触的空气中的CO2发生酸化。12. 以离心机最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。13. 在每个回收柱内加入500 l Buffer BW，用最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再 将回收柱放回收集管中。14. 重复步骤 13 一次。15. 将回收柱放到一个新的2ml收集管中，以离心机最大转速离心1min，移除所有的残余 液体。16. （推荐）将回收柱放到一个干净的1.5ml离心管中，56°C加热5min，使残余的液体完全 蒸发。17. 再将回收柱转移到一个新的1.5ml离心管中，在每个回收柱的滤膜上加20山Buffer EB， 然后15000g （12000rpm）离心1min洗脱DNA。要增加洗脱的DNA产量，可以再加20山Buffer EB，最大转速离心洗脱一次。洗脱的DNA如果要存放不超过24h，建议28C保 存；如果需要存放超过24h，建议-20C保存。使用该试剂盒洗脱的已经转化的DNA可 以在-20C保存至少3年，其质量和性能不会降低。