实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相 比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活 性，神经传导因此受阻，引起神经麻木乃至死亡，对人类安康造成极大危害。对于果蔬中的农药通常采用 气相色谱等方法进展分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。长期以来在大部分果蔬市 场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进展快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测 仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。一、实验目的1. 理解果蔬中残留农药的分析方法；2. 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法；3. 理解农药残留性评价的意义。二、实验原理有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介 质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残 留进展检测。以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶ACHE的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫 双对硝基苯甲酸DNTB产生显色反响，使反响液呈黄色于410nm处有最大吸收峰。根据酶促反响动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水 解，反响速率可以用吸光度值随时间的变化率K0来表示。当有机磷和氨基甲酸酯类农药参加到酶的显色 体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反响速度，此时体系吸光度随时间的变化率为Kt，那么 有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y的计算公式如下：Y = K0 Kt x 100%吸光度 AK0线的斜线的斜计算。定一次 点如下K0：空白样品的吸光度随时间变化曲 率值Kt：样品溶液的吸光度随时间变化曲 率值t1234567AA1A2A3A4A5A6A7其中K0和Kt都可通过以下过程进展推导和在样品的测量过程，选取每隔等步长时间测吸光度值，3分钟内共测定7个数据点。设数据表：那么线性回归所得At曲线的斜率K为：Z tA -1Z 七乙.K =Z t2 - |(Z t )2(A + 2A + 3A + 4A + 5A + 6A + 7A )-!(1 + 2 + + 7)x(A + A + + A )_1234567 7127(12 + 22 + + 72) - 7(1 + 2 + + 7)23（A - A ） + 2（A - A ） + （A - A ）=71625328I I I I I I3 lg（ -0 于）+ 2 lg（ -0 -J2） + lg（寸 -J3）=70605028III3lg（广）+ 21g（言）+ lg（广）=76528由此结果可以看出，K值的求取可以不需要使用I0值，即实验中不需要使用蒸馏水来校正I0值，在光源具有稳定性的 前提下通过仪器的硬件电路实现，I0值对测量结果不会有影响，这样就可以简化步骤，只用测出空白样品和实际样品溶 液的光强I17，计算出K0和虬，最后得出抑制率Y值。采用乙酰胆碱酯酶测定残留农药时，当酶完全水解底物乙酰胆碱时，溶液显黄色，其抑制率为0%， 当酶活性被农药抑制而部分水解乙酰胆碱，测定溶液显淡黄色，出现相应的抑制率，当酶完全被农药抑制， 测定溶液显无色，抑制率为100%，这样就可以建立起农药残留量与酶活性抑制率之间的关系。因此可以 通过测定抑制率的大小来显示农药残留的毒性程度。样品的毒性等级分为：平安、低毒和高毒。毒性等级 和抑制率之间的关系如下：表4-4抑制率和毒性等级的关系抑制率Y毒性等级< 20%20% 50%> 50%平安低毒高毒三、仪器和试剂1. 仪器农药残留检测仪1台天平）1台组织捣碎机1台一次性手套1双金属镊子1支试管架1个移液管架1个20mL离心试管3支10mL具塞试管4支5mL吸量官5支1 mL吸量官3支或移液枪50-250 p L1套）2. 试剂提取液：将两袋粉剂倒入500mL瓶内，参加510mL蒸馏水，摇匀溶解后备用。稀释液：将两袋粉剂倒入250mL瓶内，参加100mL蒸馏水，摇匀溶解后备用。酶液：每瓶酶粉加2.6mL稀释液，摇匀后置4°C备用，配好的酶液在4°C下可使用7天。底物：每瓶底物粉剂中参加2.6mL蒸馏水，摇匀后置4C备用，配好的底物液在4C下可使用3天。冷冻保存可使用15天。显色剂：将二袋显色剂粉剂混合瓶内，参加32mL稀释液，摇匀溶解置4C下备用。四、实验步骤1. 样品预处理戴上手套将蔬菜样品剪成约1cm2,用天平准确称取1g剪碎后的蔬菜样品放入20mL离心试管中，；参 加5mL提取液浸没叶片，不断摇振5min，静置20min后，取上清液2.5mL置于10mL具塞试管中待用。2. 样品测定(1) 空白样品的测量：向1支10mL具塞试管中依次参加2.5mL提取液，0.1mL酶液，0.1mL显色 剂，混匀后将试管放入37r水浴中放置15分钟，15分钟到达时，马上参加0.1mL底物混匀， 约1分钟后倒入比色皿中放入农药残留检测仪进展空白测定，记录3分钟内仪器显示的光强值 L、I2、I3、I4、I5、I6、17,计算K0。同时做3份平行样。/(2) 待测样品的测量：向盛有待测样品提取液的具塞试管中，依次参加0.1mL酶液，0.1mL显色剂 混匀，将试管放入37r水浴中放置15分钟，15分钟到达时，马上参加0.1mL底物混匀，约1 分钟后倒入比色皿中放入农药残留检测仪进展测定，记录3分钟内仪器显示的光强值I、I2、 I3、I4、I5、I6、I7，计算Kt。同时做3份平行样。并且计算样品的抑制率Y，判断毒性等级。五、数据处理通过以下公式计算蔬菜样品的抑制率，并判断毒性等级。3lg(f) + 2lg寿)+ lg( L) 椿=728HT23)- K + K + K K = 01050303/ 'I'、/'3 lg(产)+ 2 lg(产)+ lg(产)Kti=7。=1,2,3)28K = K1 +K2+K3 t3蔬菜样品的抑制率K - KY = 0 t x100%K0六、考虑题1. 果蔬中农药残留的分析方法有那些？2. 影响酶抑制法分析结果的主要因素有那些？为什么？3. 影响农药残留性的因素有哪些？
