transwell实验(整理版)

第一节 概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。1Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性 的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器(Membrane filters )，也可认为是一种有通透性的支架(permeable supports )。更准确地说,Transwell应该是一种实验技术这项技术的主要材料是Transwell小室Transwell chamber， Transwell insert)，其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而 不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孑b径大小有0.1-12.0pm，根据不同需要可用不同材料，一般 常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane )。下图是一个Transwell装置的纵切面 Fig2寺;Il i椅 f|!i ' pI yc i e e：e pbt iiT-e将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装 下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而 可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。Fig3应用不同孑径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种 方面的研究。下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具 体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：(1).共培养体系：小于 3.0um 孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0|im以下孔径。常用0.4、3.0|im。我们实验室用的是0.4pm。Fig4将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。(2).趋化性实验可用 5.0、8.0、12.0pm 膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成 分对上室细胞的趋化能力。 细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生 的物质对细胞A的趋化作用。 趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋 化作用。(3) .肿瘤细胞迁移实验常用8.0.12.0pm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分 高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。(4) .肿瘤细胞侵袭实验常用8.0.12.0pm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细Fig5胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室， 先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs )将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映 肿瘤细胞的侵袭能力。第二节 Transwell 侵袭实验我的课题涉及TranswelI侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此 这里主要谈谈 Transwell 侵袭实验。1实验用品：Fig6 Transwell 小室:多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon 公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介 绍的 Thincert。 这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的 Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每 个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。Coster和Corning公司生产的 小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有 40 左右，应该比较适合 中国国情。下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。linanping1979战友提供的价格:coster 的24孑L板的transwell的价格是456元RMB,8|im,用于肿瘤的侵袭实验。iceyxy战友提供的价格： Millipore的8|im的50个1760RMB,0.4|im的2000多，是一次性的。梅林战友提供的BD价格： 240RMB块(6.5um,24 孔,12instert)，好像是没胶的。liguofan 说国产的 boyden30 块一个。jjyy 提供的价格是:corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950 人民币不到。平均每个20元不到。Transwell 小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的 Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用 前用紫外里外都照30min°sword01战友提供的处理方法:用棉签轻轻擦去胶和反面细胞清水冲洗， 超声清洗，低挡，30min，清水3x5min，蒸馏水3x5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反 面6h，微波，低火10minx2。因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前 的Chemicon ECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄 很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说 Costar 和 Corning 也是可以重复用的，大 家可以试试。victoh 战 友 对 Millipore 公 司 的 millicell 有 比 较 详 细 的 讲 解 ， 链 接 如 下 : http:/www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2082166_1.html 本人没见过，有兴趣的可以自己研究一下。另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。Transwell小室用 过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以 试试。maojianwen战友的使用方法：trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒 精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油(注意用无色较稀的)将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余 的边缘。再照紫外。 上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。 细胞：值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs 的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行TranswelI侵袭实 验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwel l侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不是笔小数目， 还是小心为妙。另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12-24h，再进行实验。 基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和IV型胶原，生产厂家有BD、美国 Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞 外基质，4 度时是液体，在 37 度会逐渐凝固成胶状 ，不可逆。同样的东西在 sigma 叫 ECM。 zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500左右。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。 下层培养液：下层常用含5%-10% FBS的培养基具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS 浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS 仍是最合适的。 细胞培养板：常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孑b最常用。细胞培养 板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室 相配套。 此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin , FN , Sigma有售)，这样做的目的是使穿过 膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原(collagen )或明胶(gelatin )。很多战友认为这不是必须 的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认 为，如果培养时间很长(>24h),细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层 涂上FN。另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。zhangyong1036战友提供的价格：sigma的fibronectin，价格在1500左右。2步骤2 . 1 Transwell小室制备2.1.1无基质胶Transwell小室制备 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4°C风干。如果需要在下室面铺FN 的话，可将200ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen )的话，一般配成 0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37C, 30min另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80|il (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37C 30min使Matrigel聚合成凝胶。2.1.2有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300川预温的无血清培 养基，室温下静置15 - 30min ，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。2.2 制备细胞悬液 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24h ，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 12 遍，用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细 胞密度至1- 10x105，个人认为不要超过5x105具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜 的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点， 所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞 预处理而不得不分开计数，