Pacbio 第三代测序仪

第三代测序-单分子实时测序一，PacBio RS平台介绍二，PacBio RS测序仪系统服务领域1，动植物复杂基因组测序2，真菌基因组完成图3，细菌基因组完成图4，BAC克隆完成图5，从头组装(DE Novo Assembly)三,天津生物芯片提供的PACBIO RS系统测序方案四，PacBio RS测序仪系统优势五，PacBio RS测序仪系统原理一，PacBio RS平台介绍PacBio RS测序仪系统是太平洋生物技术公司(Pacific Biosciences)基 于单分子实时(SMRT)测序技术的第三代测序平台，可以在一天内完成从样品制 备到测序和读取序列的全过程。天津生物芯片利用PacBio RS测序仪系统全面解 决了二代测序几大困扰：海量数据拼接难，变异检测假阳性高，稀有突变被淹没, 高GC含量区域无法跨越，高度片段无法准确测定等，得到高质量，完整的数据 信息，为合作伙伴提供优质的基因组组装，目标区域测序，碱基修饰检测等技术 服务。二,PacBio RS测序仪系统服务领域1, 动植物复杂基因组测序(1) 杂合基因组：杂合基因组主要指杂合率高于0.5%的二倍体基因组，如大部分 水产类和昆虫等； 高重复基因组：主要指重复序列比例高于50%的二倍体基因组，大部分林木;(3)超大基因组：基因组大小大于3G,甚至是10G以上的物种，如两栖类，部分 林木；(4)多倍体基因组：如四倍体、六倍体植物等。hi I I 11 I I I 11 Mi CH O BZDEHI 111 I I III I I 1 111 Icn on m LEi i rm i i rn n o LEDR mrmmn O CD O EHR' ODumrnnIIIIIBcIII I 1 11 I I I 11 Mlo o o o co o JOiio co o o o O RR-图1主要技术策略示意图2，真菌基因组完成图(1) 适用于所有真菌菌株；(2) 尤其适合超咼GC/超低GC真菌；(3) 其它用传统方法测序比较困难真菌; 真菌基因组草图或精细图补洞。3,细菌基因组完成图(1) 普通细菌快速完成图构建；(2) 尤其适合超高GC/超低GC细菌；(3) 其它用传统方法测序比较困难细菌菌株通过采用第三代测序技术，直接进行细菌基因组的完成图绘制。4，BAC克隆完成图通过PacBioRS平台进行单分子实时测序，可以快速得到超长读长。再加大 测序深度，PacBio序列可以产生非常均一覆盖度，在大部分目标区域内，可以 接近100%的覆盖度。这种方式对于有超咼GC含量、超低碱基复杂度等BAC克隆非常具有优势。 根据 PacBio 公司提供的 Poster,由 IPacific Biosciences 公司和 University of Washing ton, Sea ttle对人类基因组一个约1.6Mb的片段，总共8个BAC克 隆进行了 PacBio测序，对比了 Illmina测序，总体上得到了非常好的效果。(见 下图)Fin 渤 rdLengthLrngOi4 Pftrapt% aiiflnedSeptGap sizeInumina «ly gnll 那PE seq onw»CH17- 皿曲T11SB61110AUXCH17- 157L1&111S6MXCH17-169A3J屈曲2?审卿162CH17- 202L17HS.1M4口打51C-H17-227A3加別J3BD3SP*338.&IJ$«CH17-33G344 SfiYB.i2.27111CH17-man199.E?Hi1256価T4Me I. BW3时白亡灶也gw®卩就Bid白帖BMds5，从头组装(DE Novo Assembly)PacBio RS平台是目前唯一能完成完整基因组组装，结构测定和基因分型 的微生物测序平台。该平台可以用PacBio数据独立完成微生物基因组的完整拼接，也可以将PacBio长读长数据和二代测序短读长数据进行混合拼接完成基因组。58 Contigs三，天津生物芯片提供的PACBIO RS系统测序方案PACBIO RS系统可提供多种SMRT测序方案，如标准测序、环形比对测序、频 闪测序，每种方法都利用了长片段读取的优势并结合SMRTbell模板形式（模板 处理后形成的一个类似哑铃的结构）和单DNA聚合酶原理。1）标准测序：从插入片段的一端测到另一端，只测一次。适合插入片段在 l-6Kb间。主要应用于再测序和重头测序。2）环形比对测序：从插入片段的一端测到另一端后，由于模板是哑铃状结构 的，因此，继续测序将得到互补链的序列信息，从而可通过对插入片段的反复测 序来获得高准确度的单分子测序结果。适合插入片段在250-500bp。主要用于发 现和确定稀有变异。3）频闪测序：由于激光连续照射会对DNA聚合酶活性造成一定影响，因此, 可以通过将激光器按照一定间隔打开和关闭，获得相对标准测序来说更长时间的 聚合酶活性。这样可获得一系列分散的读取序列从而增加对超长插入片段的物理 覆盖率。适合长度高达10K的插入片段。主要用于结构变异的鉴定或者对复杂 重复区域的拼接。在每一种测序方案中，用户都可以调整参数，适合多种应用和项目类型。这种灵 活性也提供了分多个步骤解决一个问题的能力。四, PacBio RS测序仪系统优势采用PacBio RS平台，进行单分子实时测序（single molecule, real-time SMRT）主要技术优势有：1、超长的测序读长：平均测序读长能达到3, 000至5, 000碱基，最长的序列 能达到20， 000碱基；2、极端的准确率：对基因组组装和基因组变异检测，可以最多达到99.999%的 准确率；选用特殊测序模式，测序准确率可以在达到单个分子99%准确率的条件 下，读长超过经典的Sanger测序法；3、极度的敏感性：可以检测频率在0.1%的minor variants；4、直接检测广泛的碱基修饰：除了 5-me thylcy to sine修饰以外，还可以检测 N6-methyladenine, N4-methylcytosine, DNA氧化损伤 以及其它碱基的修饰.5、最小的GC偏向性（GC bias）：在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测 定，从而保证序列的均匀覆盖度；6、无PCR扩增偏向性：样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCR arti fac ts.五，PacBio RS测序仪系统原理PacBio RS测序仪系统的关键优势是能够对单个DNA （脱氧核糖核酸）分子进 行测序，而目前市场上的主流测序仪只能对分子群体进行平均测序。单分子测序 能对DNA中罕见的序列变异进行分析，也不需要在测序之前对DNA样本进行放大, 因为放大过程可能引发错误，导致对某个DNA序列检测失败。其工作原理是用一 种聚合酶将DNA的复制限制在一个微小的间隙中，给各种碱基加上荧光示踪标 记，当碱基合成DNA链时，这些荧光标记就会发出不同颜色的闪光，根据闪光颜 色就可识别出不同的碱基。