中草药添加对大黄鱼基因表达的影响

摘 要谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内重要的氧化酶类之一。大黄鱼是我国重要的海水经济鱼类,也是宁德市的特色产业之一。本实验通过在大黄鱼饲料中添加不同比例的中草药复方(太子参巴戟当归枸杞茯苓白术),饲喂30天后，以脾脏组织为实验材料，采用实时荧光定量PCR技术分析饲喂中草药后GSH-Px基因的相对表达变化。结果显示：与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降(E5组除外)，E3组的表达量下降最多(43%)，其次是E1组(31%)，E5组的表达量比对照组升高19%，但是各组间均无显著性差异(P大于0.05)。本研究结果为中草药作为饵料添加剂在大黄鱼饲料中的应用提供了基础数据，也为中草药作为鱼类免疫增强剂提供了前期研究基础。关键词：大黄鱼；基因表达；GSH-PxAbstractGlutathione peroxidase (GSH-Px) is one of the most important peroxidase enzymes in the body, which has an important effect on the innate immunity of fish. Larimichthys crocea is one of the most important economic fish in China and sea water is also one of the characteristic industry in Ningde. In this study, adding different proportion of Chinese herbal medicine compound were added in the feed of L. crocea (radix pseudostellariae, ba ji, angelica, medlar, poria cocos, atractylodes and so on). After feeding after 30 days, the spleen was isolated and extracted for RNA. The real-time fluorescent quantitative PCR was used to analyze the relative expression of GSH in different groups. The results showed that compared with the control group, the gene expression in each experiment group were decreased (with the exception of E5 group), and the expression of E3 group decreased most (43%), followed by E1 group (31%), the expression of E5 group amount higher than the control group was 19%, but there was no significant difference between groups (P is greater than 0.05). The results of this study was to Chinese herbal medicine as bait additives provide basic data for the application in the Larimichthys crocea feed, also provides the Chinese herbal medicine as a fish immune enhancer prophase research foundation.Key words: Larimichthys crocea; Gene expression; GSH-Px目录1 引言11.1大黄鱼11.2中草药及太子参主要简介11.3 GSH-Px基因22 材料和方法32.1 材料药品及仪器32.1.1原料鱼处理32.1.2试剂42.2 方法42.2.1总RNA提取42.2.2 RNA凝胶电泳42.2.3 RNA定量分析52.2.4 RNA反转录52.2.5 SYBRGreen实时荧光定量PCR53 实验结果及分析63.1 RNA的质量检测63.2熔解曲线分析73.3基因表达分析74 讨 论84.1 中草药添加相关应用与前景84.2 中草药添加对GSH-Px基因表达的影响84.3 总结9参 考 文 献10致 谢12中草药添加对大黄鱼GSH-Px基因表达的影响1 引言1.1大黄鱼大黄鱼（Larimichthys crocea）辐鳍亚纲,鲈亚目,石首科,黄鱼属又称黄花鱼黄瓜鱼黄鱼等因体色金黄肉质细嫩营养丰富,受到了广大消费者的喜爱,是我国近海洋经济鱼类之一1大黄鱼作为我国海洋鱼类的重要组成部分，有着最大规模的海水养殖基地。以宁德为代表，它是我国大型黄鱼产业的发源地，也是大黄鱼最大养殖基地。大黄鱼的养殖不仅促进了宁德当地的水产养殖业，还成为了闽东的支柱产业1986年大黄鱼人工繁殖技术获得重大突破，也标志着大黄鱼人工繁殖技术取得了长足的进步，带来了可观的经济效益。但由于环境污染和种植规模的不断扩大，近年来病害问题屡见不鲜，造成巨大损失。近年来，随着新鲜冰饵的长期投喂、养殖环境的变化、养殖规模的不断扩大、集约化水平的提高和饲养管理水平的落后，使得水产养殖的生长缓慢、病害频发、药物消耗和频度增加，我国水产养殖业的健康发展整个养殖业受到了制约。因此，开发环境友好型饲料添加剂，促进水产养殖的生长，增强抗病能力，已成为水产养殖业发展的新趋势1-31.2中草药及太子参主要简介中草药的一些特点决定了它在鱼病防治运用中占据优势。特点一：中草药资源丰富且加工步骤简单。在中草药资源方面，我国有垄断优势。中国是中草药的发源地，目前约有1.2万种药用植物，同时中草药加工的步骤和使用方式比较简单。特点二：它可以和生态环境友好和谐相处。因为它是天然药品,比较容易被鱼类所吸收以及排出,这也避免了对鱼类造成二次伤害，一定程度上保护鱼产品质量不受影响。第三，中草药产生的毒副作用比较小。相对于化学品而言，中草药本身的毒性要低得多。对于现阶段中草药的鱼病防治的实践而言,并没有形成鱼类抗药性的问题，因此可以进行适当地应用。第四，中草药具有抗应激作用，部分中草药可以提高动物对有害外部刺激的防御能力，如在水生动物铜中添加黄芪多糖，可以增强抗缺氧、抗疲劳的抗应激能力。”Rebca等试验结果表明，不同脂肪含量和不同成熟度淀粉对比目鱼仔鱼的生长没有显著影响，但在NH急性应激试验中，低脂肪含量和低淀粉成熟度加热对比目鱼仔鱼的累积死亡率有显著影响显著高于其他治疗组（P<0.05）。因此，合理使用中草药免疫增强剂，不仅可以缓解化学药物和抗生素引起的耐药性和育种药物残留，而且可以提高机体免疫力和动物的抗病能力，中草药作为水生动物兔病促进剂的研究越来越受到水产养殖界的重视。太子参是孩儿参属的一种干燥块根，又称双批七童参等。味甘、微苦、性平4。太子参作为一种珍贵的中草药，其公认的功效一个是益气健脾，临床中主要用于功能性消化不良的，身上乏力、食欲纳差，看着食物没有胃口。还有一个是长期久病的人，身体虚弱，用它来补益气血，主要是补气。另一方面，太子参还有益气生津的作用，用来补脾肺之精气。患者主要表现为口干、口燥、津液不足的症状，临床中用太子参来益气生津。还有其他作用:磷脂能提高免疫功能，保护细胞完整，降低血脂，健脑，预防脑血管疾病5太子参多糖的主要成分是蔗糖、槐糖、麦芽糖、php-a和php-b，它们对不同栽培方法和产地的太子参多糖含量有很大影响。研究表明，太子参的含糖量在79月份较高，且随着贮藏时间的延长，太子参多糖含量会逐渐降低。其中福建省柘荣县栽培的品种多糖含量最高。皂甙由皂甙元和糖组成，它们在陆地上的高等植物中很常见，也存在于一些海洋生物中。它具有良好的生物活性，主要包括皂苷A、-胡萝卜苷尖叶丝石竹皂苷D。迄今为止，已发现16种多肽，它们是其组成中的关键化学成分。与线性环肽相比，生物活性环肽具有更好的抗酶和抗化学降解能力6。太子参块根不仅含有多糖、皂苷、环肽类还富含多种人体必需微量元素，例如FeCuZnMn,还有人体必需氨基酸其中以天冬氨酸谷氨酸精氨酸的含量较高7。此外，它还含有多种挥发油和磷脂。在对小鼠和猪的研究中发现，太子参可以提高机体的免疫保护作用8-13。例如吴建华等连续7天饲喂每公斤仔猪体重为0.5克的太子参。研究表明，太子参可增加仔猪血液中白细胞数量，延长猪瘟抗体存在时间，有效提高抗体水平。孙碧等设计人参多糖对小鼠心肌缺血再灌注损伤的实验，发现人参多糖能有效减轻心肌结构损伤，调节心肌细胞凋亡在水生动物中，在南美白虾和鲤鱼中添加太子参作为诱饵是很常见的。据王芸等14报道，饲喂复方中草药可有效提高南美白对虾的抗病能力，并可随着饲喂时间的延长而不断提高其抗病能力。李义等15采用黄芪等多种中草药作为饵料添加剂,能有效提高罗氏沼虾的免疫功能。吴斌16将不同质量比例(0.1%0.2%0.3%0.5%)太子参多糖做饵料添加剂饲养福瑞理发现在0.3%太子参多糖添加量下，福瑞理自身天然免疫系统得到明显改善。然而，作为一种食品添加剂，大黄鱼中的太子参还没有报道。1.3 GSH-Px基因谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)于1957年由Mills从牛红细胞中发现, 分子结构中含硒，故又名硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GSH-Px)，GSH-Px是广泛存在于机体内的重要过氧化物分解酶之一，能够把机体内的还原性GSH催化成氧化型GSH。谷胱甘肽过氧化物酶具有以下主要功能：（1）在机体内起到消毒作用。可以将体内的H2O2转化为H2O，也可以把脂质过氧化物还原为ROH17，从而在体内起到消毒作用（2）降低有机氢过氧化物对机体的损害。在生物体处于病理状态的时候，有机氢过氧化物可破坏细胞膜，GSH-Px可以通过转化过氧化物来降低其对机体的损害。（3）作为一种抗氧化酶，GSH-Px通常与SODCAT等协同作用,不仅能维持机体内正常的氧化还原水平18-19,还能作为鱼类受污染物胁迫时机体产生的氧化压力的指示剂20-21。(4)调节前列腺素的合成。GSH-Px可以通过将前列腺素转化为无活性物质参与到前列腺素的合成中。（5）其他作用。硒和GSH系统在氧化防御反应中起到关键作用，GSH在代谢细胞信号传导和蛋白质相互作用中也具有辅助性功能,还可以调节机体防御反应，例如：可以预防过亚硝酸盐的生产，进一步保护细胞不受亚硝酸盐的损伤。本论文以大黄鱼为研究对象，尝试将以太子参为主的中草药作为饵料添加剂应用在大黄鱼饲料中，通过分析比较大黄鱼体内不同组织间过氧化氢酶基因相对表达的变化，在一定水平上分析中草药添加剂对大黄鱼抗氧化酶系的影响，也为中草药影响鱼类免疫的研究提供基础数据。2材料和方法2.1 材料药品及仪器2.1.1原料鱼处理本试验所用大黄鱼为宁德鼎城水产有限公司幼年黄鱼，体长（23.45±0.83）cm，体重（34.05±8.23）g，健康，规格相同。原料鱼共分六组饲养分别为:123456