PCR体系配置与优化

PCR 体系配置与优化1 模板模板可是 PCR 的关键，模板的质量是 PCR 成功的先决条件，巧妇难为无米之炊嘛！ 怎样得到模板，这可是一个大题，仅仅一个提取基因组DNA就有很多的名堂，这会是我们后 面专辑的内容，这里不多说啦，有题来论坛讨论吧。P不出东西的时候不妨先考虑：模板有 没有题？（DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的 试剂，如SDS，在浓度低至001%时就会抑制扩增反应。）所需的最佳模板量取决于基因组的 大小。你的目的片段在基因组中占多少？至少要保证模板中含有一个单拷贝吧!100ng到1临 的人类基因组DNA，相当于3X104到3X105个分子。所以对于单拷贝基因,这需要01 “g 的人基因组 DNA,10ng 的酵母 DNA,1ng 的大肠杆菌 DNA 扩增多拷贝序列时, 用量更少灵敏的 PCR可从一个细胞，一根头发,一个抱子或一个精子提取的DNA中分析目的序列模板量过多则 可能增加非特异性产物DNA中的杂质也会影响PCR的效率。2引物引物以干粉形式运输。最好用TE重溶引物，使其最终浓度为100氏TE比去离子 水好，因为水的H经常偏酸，会引起寡核苷的水解。当然，如果担心TE对于PCR的影响， 不妨用ddH2。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20。以大于 10卩浓度溶于TE的引物在-20°C可以稳定保存6个月，但在室温（15°C到30°C ）仅能保存不 到1周。干粉引物可以在-20°C保存至少1 年,在室温（15C到30C ）最多可以保存2个月。 注意：溶解之前先离心一下，防止一开盖就飞了。引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓 度一般在01到05氏较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。3 聚合酶的选择主要考虑两个方面：用途对保真度的要求高不高？成本高保真 的酶总是会贵一些的。综合考虑一下找个平衡点吧，当然啦，该花钱的时候可不能省。 TqDNA 聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3'到 5'外切核酸酶（校正）活性。使用带 有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比TqDNA 聚合酶低。在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述，大不妨比较一下。提醒一点：高保 真酶除了我所知的erk的Esy-A以外，都不会在3'端加A尾巴（因为其3' -5'外切酶活 性），所以做TA克隆的时候需要一点小诀窍一一扩增完了再加普通Tq去加个A。另外还有 个方法：将 TqDNA 聚合酶同带有 3' 到 5' 外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得 比单独TqDNA聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及扩增长模板。4g2 +浓度镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引 物退火，这会影响特异性。 dNTP 和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子 的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200MNTP的典型PCR 起始浓度是15m （注意：对实时定量PCR，使用3到5m带有荧光探针的镁离子溶液）。在多 数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。 了确定最佳浓度,可以用01-5mmolL的递增浓度的g2+进行预备实验，选出最适的g2+浓度。 在PCR反应混合物中，应尽量减少有咼浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能 影响g2+离子浓度的物质，以保证最适g2+浓度。5dNTPs高浓度的dNTPs会对扩增反应起抑制作用。将每种dNTP的浓度从200卩降低到 25-50卩可以使扩增产物获得满意的产率。6KCl标准浓度为50mmolL,对于较短片段可将其提高到70-100mmolL