膜过滤技术在食品饮料微生物检测中的应用
栗 壮 2016.09膜过滤技术在食品饮料微生物检测中的应用Company presentation2Agenda膜过滤技术介绍膜过滤技术应用膜过滤技术常见问题分析食品饮料微生物检测解决方案膜过滤技术介绍4微生物检验方法微生物检验方法涂布法涂布法薄膜过滤法薄膜过滤法倾注法倾注法4MPN法法平皿平皿法法划线法划线法划线划线法法 适合做单一菌落（适合做单一菌落（Single colonySingle colony）的分离）的分离5涂布平板法涂布平板法 优点优点传统方法快速，简单广泛的选择性琼脂用于不可过滤产品 局限性局限性有限的样品体积不能冲洗掉抑制物质计数不准确倒平板法倒平板法1.0 mL 稀释过的样品大豆酪蛋白营养琼脂融化后&冷却到45oC混匀 优点优点传统方法快速，简单广泛的选择性琼脂用于不可过滤产品 局限性局限性有限的样品体积不能冲洗掉抑制物质无法观察到典型形态注意力不集中视力疲劳将导致观察平皿菌落计数结果偏差10-110-210-3Incubate最大可能数最大可能数法法（MPNMPN法）法）8也称稀释培养计数，制备3个连续稀释级供试液，每一稀释级取3份1mL分别接种至3管液体培养基中，培养后观察是否有微生物生长，根据微生物生长的管数从表中查需氧菌总数的最可能数。 优点优点传统方法广泛的选择性培养基用于不可过滤产品 局限性局限性工作量大多步稀释和操作额外的准备和清洁时间无法计数 (微生物的可能数量)需要附加实验确认总实验时间长 LST薄膜过薄膜过滤滤法法无菌滤杯加样品冲洗将膜片转移到培养基上并培养9 优点优点可将抑菌物质冲洗掉可测试大体积样品统计学意义上更可靠敏感度高，可达1CFU 局限性局限性只适用可过滤样品固体颗粒可能会堵膜3193JEFiltration 过滤Retention 截留Recovery 恢复生长 检测方法选择不当，会造成假阴性和假阳性的检测结果！产品中防腐成分残留，造成假阴性！Improper Rinsing操作过程受到污染，造成假阳性！11根根据样品特性据样品特性选择合适的检测方法选择合适的检测方法12不同检测方不同检测方法法间间的的比较比较平板平板涂涂布布法法平板平板倾注倾注法法滤膜滤膜法法样本量样本量最大约0.2 mL最大约2 mL任意菌落生长菌落生长 情况情况示例示例13涂涂布布法法与与倾注倾注法的菌落生长情况法的菌落生长情况平板表面涂抹法平板倾注法Micrococcus luteus藤黄微球菌 SCD, 30Presentation title in footer | 00 Month 000014平板倾注法薄膜过滤法薄膜过滤薄膜过滤法法与与倾注倾注法的菌落生长情况法的菌落生长情况方法对方法对比：直接接种法比：直接接种法 vs 薄膜过滤法薄膜过滤法15直接接种法直接接种法薄膜过滤法薄膜过滤法样品量样品量样品处理量有限，通常为12ml允许测试大体积样品，1毫升至数升菌落形态菌落形态菌落小，不容易识别膜片上的菌落更容易识别灵敏度灵敏度低灵敏度更敏感，可达：1CFU 抑菌性抑菌性有抑菌问题有效去除样品中抑菌成分工作量工作量每次需要倒大量的平板准备时间少，可提前准备好培养皿菌落识别菌落识别不易观察容易观察，在24小时内即可提供（有/无）信息菌落分离增殖菌落分离增殖接种量少，不能够分离和增殖不连续的细菌菌 落能够分离和增殖不连续的细菌菌落表面冲洗表面冲洗接种后不能够冲洗膜片表面可以冲洗Presentation title in footer | 00 Month 000016MPN法法薄膜过滤法薄膜过滤法样品量样品量样品处理量有限允许测试大体积样品，1毫升至数升精准度精准度半定量，精确度差，得到近似值精确度高，可达：1CFU 工作量工作量每次需要准备大量的试管培养基准备时间少，可提前准备好培养皿适用范围适用范围适用需氧菌总数，一般在没有适宜计数方法时使 用，不适用霉菌计数可检测需氧菌总数、霉菌酵母菌总数方便性方便性操作不便，需对样品做一系列稀释，误差大，重 复性差操作相对方便，重复性好抑菌性抑菌性不能去除抑菌成分，通过稀释减弱抑菌效应膜片表面可以冲洗，有效去除抑菌成分方法对方法对比：比：MPN法法 vs 薄膜过滤法薄膜过滤法膜过滤技术应用食品饮料中的微生物污染18 猪肉感染假单胞菌发篮光 蓝铃冰淇淋感染李斯特杆菌致3人死亡 沙门氏菌污染致28名儿童吃冰淇淋中毒 100多名三亚游客感染诺如病毒，引发急 性胃肠炎 肉毒杆菌事件余震不断 食用冰块没有马桶水干净法规大事件请根据报告内容更新19 新版食品安全法实施 包装饮用水国家标准出台膜过滤技术应用20药品水饮料其他可过滤产品食品应用情况膜过滤技术由于其取样量大、检测灵敏度高等特点正得到越来越多的客户的认可，目前国内知名的食品公司，如可口可乐，百事可乐、达能、雀巢、华润怡宝、娃哈哈、农夫山泉、恒大冰泉等客户均将膜过滤方法应用于日常的微生物检测中。21食品饮料中的微生物检测22应用参考标准1、包装饮用水或天然矿泉水中铜绿假单胞菌的检测GB 19298-2014 食品安全国家标准 包装饮用水 GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法2、天然矿泉水中铜绿假单胞菌、大肠菌群、粪链球菌、产 气荚膜梭菌的检测GB 8537-2008 饮用天然矿泉水 GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法3、生产用水检测菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、 大肠埃希氏菌GB 14881-1994 食品企业通用卫生规范 GB 5749-2006 生活饮用水卫生标准 GB/T 5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法 微生物指标4、内控微生物Coliform/E. coli的检测薄膜过滤方法5、碳酸饮料、茶饮料、澄清型果汁类饮料中菌落总数、大 肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、霉菌和酵母菌等微生物的 计数检测。饮料中微生物检测（滤膜前处理）专家研讨会 专家意见和结论6、制冰厂的冰块及零售点的包装冰100ml样品中不得检出 大肠杆菌和大肠菌群香港食品微生物含量指引（2014修订版）7、产品中致病菌的富集致病菌在样品中的数量很少，需要过滤大量的样品来富集疾病预防控制中心应用参考标准 1、公共场所集中空调通风系统冷却水和冷凝水中嗜肺军团菌检测WS 394-2012 公共场所集中空调通风系统卫生规范 GB/T 18204.5-2013 公共场所卫生检验方法 第5部分：集中空 调通风系统 2、宾馆、饭店、旅店、招待所等饮用水卫生状况监测，主要检测 总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、菌落总数GB/T 18204.6-2013 公共场所卫生检验方法 第6部分：卫生监 测技术规范 GB 5749-2006 生活饮用水卫生标准 GB/T 5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法 微生物指标 3、沐浴水、游泳池水卫生状况监测，细菌总数、大肠菌群测定GB/T 18204.6-2013 公共场所卫生检验方法 第6部分：卫生监 测技术规范 GB/T 18204.9-2000 游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定 GB/T 18204.10-2000 游泳池水微生物检验方法 大肠菌群测定4、包装饮用水或天然矿泉水中铜绿假单胞菌、大肠菌群、粪链球 菌、产气荚膜梭菌的检测GB 19298-2014 食品安全国家标准 包装饮用水 GB 8537-2008 饮用天然矿泉水 GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法 5、隐形眼镜护理液中金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌的检 测GB 19192-2003 隐形眼镜护理液卫生要求 2015版中国药典 卫法监发2002282号 消毒技术规范 6、消毒产品消毒效果检验中过滤冲洗去除残留的消毒剂，生活饮 用水消毒剂与消毒器械的杀菌效果中大肠杆菌的计数卫法监发2002282号 消毒技术规范7、水产养殖行业水样中总大肠菌群检测及病毒的富集GB 11607-1989渔业水质标准 23出入境检验检疫局24应用参考标准1、机场饮用水中军团菌的检测SN/T 2528-2010 饮用水中军团菌检测2、机场生活饮用水、生产加工用水、灌溉水、自来水、海水、 地下水等菌落总数、大肠埃希氏菌、总大肠菌群、耐热大肠菌群的 检测GB 5749-2006 生活饮用水卫生标准 GB/T 5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法 微生物指标3、进出口矿泉水、纯净水中铜绿假单胞菌、大肠菌群、粪链球菌、 产气荚膜梭菌的检测GB 8537-2008 饮用天然矿泉水 GB 19298-2014 食品安全国家标准 包装饮用水 GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法 4、进出口隐形眼镜护理液中金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆 菌的检测GB 19192-2003 隐形眼镜护理液卫生要求 2015版中国药典 5、用于入海口江水检测中致病菌（霍乱、志贺氏、沙门、副溶血 性弧菌等）的浓缩。卫生检验：人体传染病病原体检测 船舶压舱水中有害因子检测：包括霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、 副溶血性弧菌、肝炎病毒、诺如病毒、轮状病毒等肠道致病菌6、检测船舶饮用水是否符合生活饮用水要求。另用于霍乱弧菌、 沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、肝炎病毒、诺如病毒、轮状 病毒等肠道致病菌检测时样品的浓缩。国质检卫【2008】544号 船舶免予卫生控制措施证书/船舶卫生控 制措施证书检查签发工作规范 SN/T 1258 入出境船舶卫生监督评定标准 GB 5749-2006 生活饮用水卫生标准 GB/T 5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法 微生物指标 7、出口美国或欧盟的弹力玩具球，水晶工艺品等所装水溶液检测 好氧微生物总数、霉菌酵母菌总数。USP 61 MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMENRATION TESTS5个个操作步骤操作步骤取取样样过过滤滤接接种种培培养养判判读读薄膜过滤技术薄膜过滤技术 薄膜过滤是通过使用一定孔径的滤膜从液体中截留微生物，然后将其放在培养基上，使该微生物在膜表面成长为菌落，最后对其进行培养、计数、鉴定等。Step 1: 取样（以水为例）取样（以水为例） 对取样阀表面进行消毒对取样阀表面进行消毒确保消毒剂有足够的接触时间 打开阀门，排水打开阀门，排水3 35 5分钟分钟冲洗消毒剂残留除去生物膜上面的脱落物 收集样品收集样品 对阀门进行消毒对阀门进行消毒ISO 19458, Water quality Sampling for microbiological analysis样品应具有代表性，应能反应整批产品的情况和工艺情况。27整批产品参数整批产品参数样品参数样品参数做放行决定做放行决定做工艺调整做工艺调整不能直接衡量不能直接衡量取样方法验证取样方法验证/相关文件相关文件 SOP 工具工具/设备设备 环境环境分析方法验证分析方法验证/相关文件相关文件 SOP 工具工具/设备设备 环境环境分析分析取样取样样品样品取样代表性取样代表性允许范围内，取样体积尽可能大。28制备样品制备样品 实验前充分混匀，目的是使样品内的微生物均匀分布 根据样品性质和微生物的含量情况，做必要的稀释 一张直径47mm至50mm的滤膜上，理想的典型菌落数为10-100个，总的菌落不超过200个。Presentation title in footer | 00 Month 000029ISO® 8199:2005 Water quality General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture稀稀释剂和培养基释剂和培养基培培养基、稀释剂和滤膜遵养基、稀释剂和滤膜遵守守 ISO
