干细胞移植治疗心脏病的发展方向

18院士论坛中国医学前沿杂志（电子版）2012年第4卷第12期基金项目：国家自然科学基金项目（81000003，81100075）；高等学校博士学科点专项科研基金（20100071120072） 通讯作者：葛均波 Email：ge.junbo2zs-hospital.sh.cn干细胞移植治疗心脏病的发展方向葛均波，黄浙勇（复旦大学附属中山医院 心内科 上海市心血管病研究所，上海 200032）损伤心肌的细胞修复是心脏病学领域的一个圣杯，细胞疗法理论上极有前途。早期动物实验和临床前研究结果具有革命性、突破性，但临床试验并未复制动物实验的辉煌战果；虽然每年干细胞研究成果汗牛充栋，但研究伊始的基本问题迄今仍未明了。困惑、置疑是新兴事物发生发展的天生伴侣，也是干细胞研究进展的最好清醒剂和兴奋剂。面对喜忧参半的现状，在此我们略论一些突破性进展。今日之蓓蕾，孕育着明日之硕果。1 骨髓细胞临床试验新进展骨髓细胞移植是目前干细胞治疗心脏病临床试验的主流。2012年国际循证医学协作组完成迄今为止最大规模的关于骨髓细胞治疗急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的荟萃分析1，共纳入20042011年间17个国家33项随机临床试验（1765例患者）。所有研究受试者接受经皮冠状动脉介入治疗（PCI）和（或）溶栓治疗作为心肌梗死的初步治疗。结果发现：干细胞治疗相关的不良事件无增加；干细胞能改善左室射血分数（LVEF 312个月，WMD 2.87%），减少梗死面积并改善左室重构；获益可长期持续（LVEF 1261个月，WMD 3.75%)；心功能改善与输注的细胞数量相关；细胞治疗并不能改善AMI后死亡率以及致残率（再次心肌梗死、再次住院、支架再狭窄和靶血管血运重建）。由此可见，虽然骨髓细胞治疗可带来心功能益处，但心功能获益并未转变为临床硬终点事件的获益，而且不同试验结果存在较大变异。因此，需要对细胞产品、细胞剂量、移植方法、移植时机和患者选择等各个移植链条环节进行标准化和优化，这不仅有利于提升骨髓细胞治疗的疗效，对其他各种新兴细胞类型的移植策略优化亦具有普遍指导价值。目前尚有30多个成体干细胞治疗心脏病的注册研究正在进行中，我们期待出现更加科学客观的循证依据。2 心脏自身干细胞成为研究新宠相比其他组织来源的成体干细胞，心脏自身干细胞（cardiac stem cell，CSC）的心脏组织分化能力无疑更加令人信服。基于使用促红细胞生成素可以促进骨髓前体细胞向红细胞分化的事实，促进心脏前体细胞的分化、进而促进心脏自我修复潜力是未来研究的一个重要方向。2011年Porrello等2将刚1周龄小鼠15%的心脏切除，发现3周内受损心脏重新完好地修复。表明在出生后的一段窗口期内，哺乳动物心肌再生是有可能的。“新生哺乳动物的心脏能够自我修复”的概念为治疗人类心脏病提供了新的思路，研究者有可能通过药物、基因或者其他方法以唤醒成年老鼠乃至成人的心肌再生能力。我们的研究3发现使用Urantide阻断Urotensin 受体能够通过增加心脏侧群细胞（SP），提高心脏修复能力，改善损伤后小鼠心脏功能。利用CSC的另外一种方法是移植到受损心19 院士论坛中国医学前沿杂志（电子版）2012年第4卷第12期肌。CSC可从活检心肌组织中分离扩增，具有较大自身移植潜力。在胚胎干细胞临床试验意外终止（2011年11月美国杰龙生物医药公司意外终止胚胎干细胞治疗急性脊髓损伤临床试验）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem，iPS）分化效能有待提升、骨髓细胞临床试验结果差强人意的背景下，业内人士对CSC寄予厚望。在大量动物实验基础上，CSC移植目前已快速推进到期临床试验阶段：TICAP研究（NCT01273857）和ALCADIA研究（NCT00981006）正在进行中，SCIPIO研究4和CADUCEUS研究5结果均发表在新近Lancet杂志。SCIPIO和CADUCEUS研究的结果证明CSC移植治疗心肌梗死是安全的，为下一步开展更大规模的期研究提供了基础。SCIPIO试验发现LVEF明显改善，梗死面积显著降低；而CADUCEUS试验发现细胞组整体心脏功能无明显改善；但活力心脏面积增加，局部心肌收缩功能改善。尽管两个试验结果不尽相同，但毕竟为近期低迷的干细胞心肌修复领域注入一注强心剂。但我们不曾忘却，数年前骨髓细胞临床试验刚登场时万民齐庆的场景，然而数年间忽然降温。曾有前车之鉴，足为后事之师，我们需要更多的样本量和更长时间的随访，以验证CSC的真正疗效。3 细胞重编程技术编织未来蓝图谱系重编程技术指成熟体细胞可以通过外源转录因子的导入，直接重编程为其他类型的体细胞或祖细胞。在干细胞领域以iPS技术为代表。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布，将成体组织皮肤成纤维细胞经过病毒载体直接转导4个干细胞相关基因（如Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc）后可以转化成为具有胚胎干细胞（ESC）特性的诱导式多能性干细胞。iPS的诱导成功是干细胞研究领域里程碑式的进展，被自然和科学杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。目前，iPS俨然成为干细胞领域的研究最热点之一。成纤维细胞是健康心脏组织的支持性细胞。心肌梗死后成纤维细胞转移至损伤部位并大量增殖，形成瘢痕参与心肌重构，避免心脏破裂。常规细胞治疗是将干细胞或祖细胞移植入损伤部位，或促进局部前体细胞分化。能否利用心脏内业已存在并与邻近细胞紧密结合的大量成纤维细胞库呢？基于谱系重编程的理念和iPS的研发经验，我们曾提出新的假设：能否将若干关键基因转导入成纤维细胞，跳过iPS阶段，使其直接“转分化”为心肌细胞？换言之，能否将心肌瘢痕组织直接转换为心肌工作细胞？基于国内实验室条件限制，我们将该假设发表于2010年Med Hypotheses6杂志。出人意料的是，国外研究很快初步验证了我们的设想。美国圣地亚哥心血管疾病格拉斯顿研究所主任Srivastava等7将Gata3、MefZc和Tbx5三种基因转移进成纤维细胞，直接成功地培育出具有收缩功能的心肌样细胞；随后他们将这3种基因编码的病毒载体直接注入新近心肌梗死小鼠的瘢痕组织，证实成纤维细胞可分化为心肌样细胞。另一项具有异曲同工之妙的原始概念验证研究来自microRNAs。microRNAs是一种小的寡聚核苷酸链，能够调节细胞内数百种基因的表达。杜克大学的Mirotsou等8发现4种microRNA分子（miRNA-1，miRNA-133，miRNA-208和miRNA-499）能将在盘碟中触发形成瘢痕组织的心脏成纤维细胞转化为心肌样细胞，进而发现microRNAs注入到小鼠体内也能实现这种转化。相比于在体内很难掌控的基因方法或干细胞移植，利用microRNA实现组织再生有潜在的优势，如mciroRNA方法不会产生基因突变，也可避免干细胞的伦理争议。细胞重编程技术是一项巨大的突破，其应用前景极富梦幻色彩：心肌梗死患者无需接受开胸手术，只需导入特定基因或microRNAs，成纤维细胞将直接转化生成健康的心肌细胞。事实上，各系统的终末期疾病几乎均与纤维化相关联，如肝硬化、肾小球硬化等，如能在原位将成纤维细胞转为各脏器相应的实质性细胞，无疑将改变整个医学实践策略。当然，能否真正实现这种梦幻般的跨越尚待验证。20院士论坛中国医学前沿杂志（电子版）2012年第4卷第12期4 移植策略稳步推进4.1 移植途径的探索 干细胞移植途径包括经静脉、经冠状静脉、经心外膜、经心内膜和经冠状窦注射等9,10。静脉移植创伤最小，但大量细胞潴留于肺组织。经心外膜或心内膜心肌内注射创伤较大，但可确保损伤局部有足够的细胞量。心肌梗死后，经导管冠脉内注射是首选方法，也是临床试验中最常用的方法，可使细胞尽量弥散分布于损伤心肌，但细胞在心脏的停留率较低。经冠状窦途径注射时细胞可弥散分布于损伤心肌，最近已被应用于临床试验11。最近进展较快的是以生物可降解材料为基础的组织工程贴片法12,13，但贴片厚度和降解物质毒性等问题有待进一步研究。4.2 促进归巢研究 无论何种移植途径，最终都需将干细胞最大限度地整合至损伤心肌，即移植细胞靶向归巢是再生医学发挥疗效的前提。不管采用何种移植途径，真正分布到心脏的移植细胞数量都极其有限，仅占0%6%。AMI后，心肌组织局部细胞因子增加，包括干细胞趋化相关因子如SDF-1、MCP-3、GDF-15、bFGF、GRO-1等14，诱导干细胞优先向心脏归巢。但许多归巢因子表达时间窗短暂，如研究最多的归巢因子SDF-1，损伤心肌表达仅有1周时间15；MCP-3不足10天16。在动物实验中，将归巢因子通过转基因手段整合入移植细胞可增加细胞归巢17。譬如，通过细胞为基础的基因治疗15、基因转导或直接使用SDF-1蛋白18均可促进干细胞归巢，进而改善血管新生和心脏功能。增加干细胞表面SDF-1受体CXCR4的表达并在心肌梗死后24小时内移植也能达成类似效果19,20。但归巢涉及的“细胞-细胞外基质-细胞因子”网络极其复杂，其中的调控机制仍不清楚。尽管近年来以归巢细胞因子为靶点的相关研究获得了一些进展，但短期内尚无应用于临床试验的可能性14。寻找新的、有效的促进归巢的方法是当前干细胞移植的难点和热点之一21,22。4.3 促进细胞的存活和植入 移植细胞的存活和植入是目前干细胞研究的瓶颈之一。蛋白酶、黏附分子和整合素等信号调控分子能诱导干细胞向损伤心肌迁移，并调节局部微环境，促进干细胞植入14,23。SDF-1等因子能诱导基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9分泌24,25。中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和MMP-2/9等蛋白溶解酶可通过裂解SDF-1的N-末端或裂解CXCR4而抑制细胞迁移25,26。在干细胞机械运动过程中蛋白溶解酶呈现时空依赖性改变，介导干细胞的招募和植入。整合素是干细胞黏附、滚动和渗出内皮组织的关键因子，造血干细胞（HSCs）可表达包括多种整合素在内的一些黏附因子。整合素迟现抗原4（VLA4）和血管细胞黏附分子1（VCAM-1）的相互作用（VLA4/VCAM-1通路）可能在HSCs植入过程中发挥关键作用，研究发现，用抗体阻断VLA-4或VCAM-1后显著减少移植HSCs的植入27。只有表达CD18的内皮祖细胞（EPCs）才能和内皮细胞表面ICAM-1相互作用，CD18中和抗体能显著抑制AMI小鼠移植干细胞的植入28。上述研究提示针对相关因子进行干细胞基因修饰可能增强细胞的招募和植入。其他增加植入和存活的策略有发现新的介导因子、移植前预分化干细胞、激活生长因子（FGF-2、IGF-1a）和抗凋亡因子（p-Akt、SDF-1、BCl-1和PDGF）等17,29。在这方面，我们在硫化氢预处理干细胞30、侧支循环微环境31、基质弹性微环境32对细胞植入、分化的作用等方面做了一些研究。我们相信，损伤心肌的细胞修复是心脏病学领域的一个圣杯，是未来心脏病学发展的重要方向，在争议声中干细胞研究将继续蓬勃发展，恰如过去十多年的历程。参考文献1 Clifford DM, Fisher SA, Brunskill SJ, et al. Stem cell treatment for acute myocardial infarctionJ. Cochrane Database Syst Rev, 2012, 2:CD006536.2 Porrello ER, Mahmoud AI, Simpson E, et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heartJ. Science, 2011, 331(6020):1078-1080.3 Gong H, Ma H, Liu