参苓白术散对大黄引起的脾虚泄泻小鼠免疫机能的影响

黑龙江中医药大学硕士学位论文参苓白术散对大黄引起的脾虚泄泻小鼠免疫机能的影响姓名：韩海荣申请学位级别：硕士专业：方剂学指导教师：高权国20060501黑龙江中医药大学硕士学位论文中文摘要目的：探讨参苓白术散对脾虚泄泻小鼠的止泻作用和免疫功能的影响，并揭示脾虚免疫功能下降与泄泻之间的机理。 方法：采用大黄泄下法制造脾虚泄泻小鼠模型，给与参苓白 术散及思密达进行治疗，观察小鼠的一般状况，摄食量，白发活 动，大便次数和性状改变；用碳末推进法观测小肠碳末推进率的变化：测定小鼠胸腺及脾重量，胸腺脾重指数的变化；用郭峰法观察红细胞C 3 b 受体花环率( R B C C3 b R R ) 和红细胞免疫复合物受体花环率( R B C I C R ) 的变化；通过尾静脉注射印度墨水来观测 小鼠巨噬细胞的吞噬功能的变化；同时观察小鼠血清淀粉酶和D 一木糖的变化；并进行病理学观察。 结果：与模型组比较各项指标均是( P 脾 虚湿热> 脾气虚，其中脾气虚与前两型间又有显著性差异，认为由于炎症程度较重，局部免疫反应加速，S I g A 产生增多以保护肠粘膜。可见脾虚泄泻与肠道S I g A 分泌关系有待进一步研究。孟毅【l0 】报道酸刺激前后唾液淀粉酶活性明显降低；北京市中医研究所、魏睦森等，1 2 1 都报导脾虚证患者木糖排泄率明显降低；沈洪 13 】报道脾虚证患者胃泌酸功能低下；金敬善等【14 】发现胃、十二指 肠溃疡病脾虚证患者胰功肤值降低，说明脾虚证者胰外分泌功能低下。北京中医医院【l5 】发现消化系统疾病和肿瘤病脾虚证患者的胰分泌淀粉酶功能低下。金敬善等l l6 j 报道脾虚证患者胃泌素水平明显低于正常人；涂福音等【i v l 则报道脾虚证患者血清胃泌素高于正常对照组；张忠兵等1 18 对3 0 例脾虚泄泻患者的研究发现结肠末端P 物质( S P ) 含量增加，乙状结肠粘膜血管活性肠肽( v l P ) 含量 明显增加。另有实验研究【1 92 02 1 1 表明：脾虚大鼠胃窦、十二指肠、下丘脑等组织和体液中胃泌素( G a s ) 含量低下，生长抑素( S S ) 含量 增高，脾虚大鼠胃粘膜D 细胞m R N A 表达增强，细胞密度增大。 以上说明脾虚证时消化系统功能是处于减退或紊乱状态。王晓明等 3 4 1 认为抗氧化酶交流导致的细胞生物膜结构与功能的异常，可能是脾气虚证的分子生物学基础。冯五金等¨5 l 将脾气虚组、肝胃 不和组、大肠湿热组、正常对照组对比发现，胃泌素在脾虚组最 低，而胃动素在三种证型中都显著高于正常对照组：P 物质在肝胃不和组最低，在大肠湿热组最高。故冯氏等认为脾虚证主要表现为胃泌素、P 物质降低，而胃动素升高的两低一高现象。刘晓颖 3 6 1 在研究脾气虚证与胃粘膜P 5 3 基因表达的关系时发现胃粘膜良性病变的加重与肝郁证一脾气虚证一脾气虚( 肝胃) 气滞证型演黑龙江中医药大学硕士学位论文变的规律相同，而胃病辨证中脾气虚证是胃粘膜癌前病变的主要 相关证型。并已经证实了胃粘膜癌前病变中脾气虚证有P 5 3 基因 的较强表达。姚永莉等 3 7 1 探讨G 细胞、D 细胞与脾虚证发生的关 系。研究发现脾虚时G 细胞数减少，灰度值增高；D 细胞数减少，面积缩小；G D 细胞数和细胞面积比值均增高。从形态学上揭示 D 细胞分泌生长抑素亢进、G 细胞释放胃泌素不足以及G D 细胞比例失调，是导致脾虚证胃肠功能障碍的一个重要病理机制。三脾虚证与体液免疫脾虚证与体液免疫的关系主要是是关于免疫球蛋白和补体方面进行探讨。主要包括外周血I g G ，I g M ，I g A 及C 3 、C 4 含量的 变化。曲长江【2 2 】等测定了用两种方法塑造的小鼠脾虚模型血清I g G ，I g M 食量结果均低于正常。许辉等【23 】以脾虚证模型大鼠为 对象，观察血清I g G ，I g M 等特异性免疫应答指标的变化。结果 示各组间I g G 的水平未显示明显变化( P > O0 5 ) 。脾虚证I g M 的水平均降低。四脾虚证与非特异性免疫近年来动物实验与临床均表明脾虚证普遍存在非特异性免疫 功能异常，主要表现在自然杀伤细胞活性以及巨噬细胞吞噬能力及嗜酸性粒细胞等细胞功能低下或数量减少。童光东等 2 4 】采用利血平和大黄复制成脾虚、脾肾阳虚动物模型，以温补培元作为药 物组，检测动物巨噬细胞功能、脾细胞N K 细胞活性，结果温补培元方组以上指标与病理模型组相比有显著性差异。章梅等 25 1也研究发现，脾虚证小鼠巨噬细胞吞噬功能显著降低。此外，章氏等 2 6 】用酶标免疫法测定6 6 例脾虚患者和健康者的血浆纤维结合蛋白含量及巨嗜细胞吞噬功能。实验表明，脾虚患者血浆纤维 结合蛋白( 血浆Fn ) 和巨噬细胞吞噬功能下降，且二者呈高度正相关( r = o 9 3 6 ) ，并认为血浆Fn 水平下降是脾虚非特异性免疫功能失调的重要方面。五脾虚证与细胞因子免疫 细胞因子相互之间既可相互协同而又可能有相互拮抗效应等黑龙江中医药大学硕士学位论文特点，形成一个复杂的细胞因子网络，发挥传递、调节细胞间、 系统间以及整体内部各部分信息的功能，实现免疫网络调节。正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体严格的调控；在病理状态 下，细胞因子会出现异常性表达，表现为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因受体的水平增加等。章梅 2 7 1 等观察脾虚患者血浆细胞因子、血清可溶性细胞黏附分子1 f s l C A M 一1 ) 和单核细胞功能的变化，结果显示：脾虚患者I L 一2 、I L 4 、I L 5 、T N F a 、I g E 水平下降，sI C A M 一1 和sI L 一2R 水平升 高，外周淋巴细胞I L 一4 、I L 5 和C D 2 弱表达；血清sI C A M 1 水平升高，I L 一1 5 分泌减少，A D C c 功能下降；提示脾虚患者免疫功能下降。魏彦明【28 】分别用利血平和小承气汤造模，用四君子汤治疗，以放射免疫法测定I L 一2 ，I L 一6 和T N F 。研究结果证明，这两种脾虚模型大鼠细胞因子I L 2 、I L 一6 和T N F 均显著低于正常对照组和四君子汤治疗组，但四君子汤治疗组与正常对照组之间以上 细胞因子的变化则无差别，或四君子汤治疗组其细胞因子含量高于正常对照组。说明脾虚时参与机体免疫调整作用的一些细胞因 子水平降低，四君子汤治疗能够提高脾虚证鼠产生细胞因子的能力，从而达到健脾益气调整机体的免疫功能。六脾虚证与免疫遗传学 脾虚证与免疫遗传关系的研究主要集中在基因及细胞凋亡等 方面。在脾虚与基因相关性研究中主要集中在P5 3 基因上，且结果大致相似。刘晓颖等【29 j 研究发现脾虚证慢性萎缩性胃炎的相关 癌基因P5 3 表达异常。刘素梅 3 0 l 等研究发现加味四君子汤可升高脾虚大鼠降钙素基因相关肽( C G R P ) 的含量。在细胞凋亡角度上，系统研究较少，如徐珊【3 l 】等对气阴两虚型慢性胃炎胃粘膜中细胞凋亡调控基因蛋白的表达进行研究，结果发现促进细胞凋亡的基 因蛋白B a x 、F a x 、P 1 6 的表达减弱，细胞凋亡受到抑制。所以关于细胞凋亡的研究还需进一步深入。七脾虚证与微量元素的关系微量元素是人体多种酶的组成成分及激活因子。众多学者己黑龙江中医药大学硕士学位论文经证实脾虚可影响微量元素在体内的吸收、分布以及排泄，从而导致血清及骨骼肌中微量元素分布的异常。张立德等【3 2 1 测定了脾气虚家兔骨骼肌微量元素的含量，发现脾虚家兔骨骼肌中钾、钠、 铜的含量减少，铁、钙、锌的含量增加。马建伟等 33 】观察了4 0 例脾气虚证患者，发现血清中锌、铜的含量下降，铜、锌比值亦下降，血清镁有升高趋势。提示脾气虚存在着微量元素代调 的异常，其含量的变化与中医脾虚证有一定关系。目前，脾虚泄泻证与免疫功能关系的研究思路可归为：1 立足整体，研究神经一内分泌一免疫调节网络，期望揭示证的本质。2 重视局部，探讨胃肠道局部免疫与脾虚泄泻的关系，期望寻找特异性指标。3 结合临床，建立适合脾虚泄泻免疫变化的实验动物模型。4 应用现代免疫学和分子生物学等高科技成果，将研究推向分子和基因水平。应进一步研究脾虚证的各种免疫功能的变 化，寻找其规律性。寻求脾虚证诊断和治疗的特异性指标，为临床指导中医诊断和治疗脾虚证提供客观依据。黑龙江中医药大学硕士学位论文实验研究实验一参苓白术散对脾虚小鼠免疫功能影响的实验研究1 实验动物昆明种小鼠1 2 0 只体重2 0 ±2 9 ，6 旱兼有，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，有动物合格证。2 实验药物及试剂 参苓白术散( 由山西华康药业股份有限公司生产，配制成含生药量0 17 6 的溶液待用) 。生大黄( 由黑龙江中医药大学附属二院门诊提供，配制成浓度为1 0 0 水煎剂待用) 。思密达( 由博福一益普生制药有限公司生产按3 9 5 0 m L 配制 成浓度为6 的溶液待用) 。 酵母多糖冻干粉( 由上海市长海医院输血科血液免疫中心提供) 。血清淀粉酶试剂盒( 试剂组成及配制：按淀粉酶测定试剂和说明书所说，将碘储备液用蒸馏水按l ：9 稀释，制备成O 0 1 m o l l碘应用液，4 避光保存待用) 。D 木糖试剂盒( 由南京建成生物工程研究所提供) 。试剂组成与配制： 试剂一：间苯三酚试剂，6 0 m l ×3 瓶，避光冷藏保存。试剂二：1 3 3 m m o l L ( 2 9 L ) D 一木糖标准品贮备液2 m l ×3 支，4 0 C保存。试剂三：标准品稀释I O m l ×1 支，室温保存。1 3 3 m m o l L ( 2 0 0 m g L ) D 一木糖标准品应用液的配制：取13 3 m m o l L ( 2 9 L ) D 一木糖标准品贮备液以标准品稀释液作l ：9稀释，冰箱稳定保存) 。D 木糖试剂( 沈阳市试剂三厂) 。 瑞士染液( 瑞士染液5 0 m l 一瓶；缓冲液5 0 m l 一瓶) 。黑龙江中医药大学硕士学位论文肝素( 由南京建成生物工程研究所提供) 。印度墨水( 天津市塘沽新华化工厂，与生理盐水按l ：9 将其稀释待用) 。0 1 N a H C 0 3 ( 汕头市化学试剂厂，将其与蒸馏水按1 ：l0 0 0稀释待用) 。3 主要仪器721 一光栅分光光度仪成都仪器f 一生产 HH S 恒温水浴锅江苏医疗仪器厂 红细胞计数仪成都仪器厂 高倍显微镜重庆光学仪器厂电子天平梅特勒一托利多仪器有限公司微量加样器上海第二分析仪器厂离心机科大创新股份有限公司4 实验方法 实验共分三个阶段，第一阶段为适应阶段，共7 天，第二阶段为造模阶段，共8 天，第三阶段为治疗阶段，共7 天。4 1 动物分组昆明种小鼠1 2 0 只古早兼有，适应性饲养一周，编号称重，随 机分为4 组，即正常对照组( A ) ，脾虚泄泻组( B ) ，参苓白术散治疗组( C ) ，思密、达组( D ) 。4 2 模型制作苦寒泻下法，除正常对照组每天用0 4 m l 2 0 9 自来水灌胃外，其余三组均用1 0 0 生大黄水煎剂( 含原生药1 9 m 1 ) O 4 m l 2 0 9 ， 每曰一次，连续8 天，造成脾虚泄泻的模型。4 3 给药方法A 生理盐水O 4 m l 2 0 9 ，一日一次定时灌胃B 生理盐水0 4 m l 2 0 9 ，一目一次定时灌胃C 参苓自术散0 4 m l 2 0 9 ，一日一次定时灌胃D 思密达0 4 m l 2 0 9 ，一日一次定时灌胃4 4 标本采集及制各黑龙江中医药大学硕士学位论文于每组小鼠中取出15 只雄性小鼠，于末次给药后1 小时，尾静脉注射印度墨水0 1 m l 1 0 9 ，并分别于2 ，1 0 分钟后，目内眦取 血0 0 2 m l