同型半胱氨酸及叶酸对内皮细胞微囊蛋白1及其基因表达的影响

同型半肤氨酸及叶酸对内皮细胞微囊蛋白 一 1 表达的影响中文摘要目的 微囊蛋白(c aveo li 介 1) 是细胞质膜微囊的主要结构蛋白， 研究显示: av eo h n 一 1可与多种信号分子相互作用， 在细胞信号转导和多 种疾病的发生中有重 要意义。 本研究观察同型半肤氨酸( h c y ) 及叶酸对人脐静脉内 皮细胞( H U V E C )。 aveolin- 1 表 达的 调节 作用。方法 使用培养的2 一 3 代 HUV EC 细胞， 将体外培养的H U V EC 分为 10个实验组: 0 、1 0 、5 0 、2 0 0 、5 0 0 u m o l / L 浓度 H c y组及叶酸( 1 5 u m o l / L ) 和上述各H c y 共同 培养组， 培养2 4h后， 采用W es te l们 b l ot和R T 一 P CR测定c av col i n 一 1 蛋白 和m R N A表达的变化.结果 与对照组( o u 。 。 1 / L H c y ) 相比，生理浓度组( l o u m o l / L H c y )c avco l i n- l含量及m R N A表达明显增高( P 1 0 0 um o 厂 L 。( 二) H cy对 血管内 皮 损伤作 用内皮细胞具有众多的生理功能: 选择性通透功能、屏障功能、血管紧张的调节、 抗血栓、细胞粘附 和聚集等。 H cy对内 皮细胞的损伤作用主要表现在以 下) 七 个方面。1、对内皮细胞屏障和再生功能的损害B eTIn an等 Ie 研究表明 ，H cy和 硫酸铜与内 皮 细胞 孵育 后， 可 使穿 过内 皮细胞单层的白 蛋白 ( 用台 盼蓝标记 ) 显著增多。内皮细胞选择性通透功能发生障碍， 可引 起脂蛋白 和胆固 醇 在血管 壁沉积，促进动脉粥 样硬化的 形成。 Lee 等71 研究发现H cy可通过梭基甲 基化， 膜活性和P Zlra s 活性降 低， 从而在G 卜 5 或其前抑制血管内 皮细胞的细胞周 期， 内 皮再生能力降低， 内 皮屏障能 力降低。 再生能力低下，内 皮层的选择性通透功能障碍，脂蛋白 和胆固醇易于在血管壁沉积， 促进 A S形成。2、 对内 皮 依赖 舒张功能 谬D v R ) 的 损害血管内 皮分泌的多种血管活性物质对于维持正常的血管紧张度至关重要，其中 包 括 一 氧 化 氮 困 0)、 内 皮 素 一 1 脚一 1) 、 前 列 环 素 (P GI Z ) 等。 Ta w a k o llsl等 在26例非动脉粥 化硬化患者中 ， 用高分辨率的血管超声发现， 高H cy血症与内 皮依赖性血管舒张功能损害相关， 当用叶 酸或维生素B 6 使其水平降至正常时， 内 皮舒哈尔滨医科大学硕士学位论文张 功 能 得以 改 善 。 u p ch urch 等 9l 的 研 究 认为 ，H cy可 通 过自 身 氧 化 产 生 一 系 列 活性氧中间产物如过氧化氢、 超氧阴离子及轻自由 基， 导致膜脂质过氧化， 内皮依赖性N o生 成减少， 同 时H cy还可引 起谷肌甘肚过氧 化物酶 等抗氧化酶活 性降 低，活性氧清除障碍，N0更易被氧化失活，内 皮依赖性N o生成减少而灭活增加， 必然导 致N O依赖性血管舒 张功能 下降。 G e ttes at er等l 0 研究发 现糖耐量 异常患 者血浆H cy与E T 一 1 水平呈正相关， 推测其原因可能为H cy促进了内皮细胞释放E T ， 同时因H cy致N o生成减少，对内 皮细胞合成E T 的抑制作用减弱也可能起一定作用。 N O生 成减少，E T 增加，E T /N0比 值增大， 加重内 皮功能紊乱， 促进A s 的发 展 。 P an g an amal a 等 1 的 研 究 表 明 H cy使 体 外 培 养 的 人 血 管 内 皮 细 胞 产 生 P GI Z减少。 N O 、P G IZ不仅是血管舒张因子， 还可抑制血管平滑肌细胞增生， 也具有抗凝功能， 抑制血小板聚集和活化，H cy抑制N o 、 P GI: 活性而促进动脉粥 样硬化。3、对内皮粘附功能的影响动脉粥样硬化形成的早期， 单核细胞与内皮细胞的粘附性增强， 促进单核细胞 在内 皮下积聚。 J ac obs en等 l2 1 报 道Hcy使体外培养的内 皮细胞 释放白 介素一 8(IL 一 8) 和单核细胞趋化蛋白 一 l( M C P 一 1) 增多。 除了 单 核细胞 ， 中 性 粒细胞 在动脉硬 化发生 发 展中 也 起一定的 作用 ，D udm an等l 3 发 现在 体外， 生理 浓度的H cy使中性粒细胞对内 皮细胞的粘附 率增加， 而内 皮细胞表达 ICA N I 一 1 、 E 一 选择素、 血管内 皮勃附分子一 1 (Vc A M 一 1 ) 表达却未增多。4 、 对内皮抗凝和纤溶功能的损害内皮细胞是机体促凝一 抗凝一 纤溶系统的重要组成部分。内皮细胞合成的因子v 、 v ll l 、 组织因 子(ti s s uefa c l o r ，T F) 等促进血栓 形成;其合成的 硫酸乙 酞肝素、血栓调节蛋白 ( 。 u o m b omo dul i n ， T M)、 抗凝血酶 1 1 1 ( an t ithro mbi nl l l ，A T l l l ) 等抑制血 栓 形 成 ; 而t- P A 、 P A I 一 1 等 则 参 与 纤 溶 系 统。 F ry er l4 1 等 的 研 究 显 示H cy以 时 间和剂量依赖方式增加体外培养的人血管内皮细胞组织因子(T F)的活性， 用定量P C R方法测出其m R 抖 A的表达增多， T F 是凝血因子V I 】j V l la的受体， 二者结合后启 动 外 源 性 凝 血 途径。 还 有 研究 11 习 发 现体 外培 养的内 皮 细 胞 和H cy孵育 后 ， 其因子V的活性和X a 致凝血酶原活化的活性均增强， 从而促进血栓形成。体外培养同型半肤氨酸及叶酸对内皮细胞微囊蛋白 一 1 表达的影响的 猪主 动脉内 皮 细胞与H cy 孵育后 ， 细胞表面的 硫酸乙 酞 肝素表达减少，致使结合 在 细 胞 表 面的A Tl n以 时 间 和 剂 量 依 赖 方式 减 少 l 6 。 另 有 研究 报 道H cy抑制T M的 作用， 使其活化血管抗凝剂蛋白c 和清除 凝血酶的 作用降 低17。 以 上作用均 使 血 管内 皮 抗 凝功 能下 降 ， 而 促 凝 作 用增强 ， 导 致 血 栓 形 成。 M idori k awa 等 口 8的 研究表明H cy可 剂量依赖地增强 体外培 养的 人 脐静 脉内 皮细胞对P AI一 1 的 表达和分泌， 而对t 一 队 却无明 显的 影响。 而在超生理剂量时， 随着浓度的 增加，Hcy剂 量依赖性地抑制tP An 1 R N A合成、 促进P AI一 I n 1 R N A基因表达119 1 。5 、对血脂的影响Hcy 可作用于低密度脂蛋白 (LD L) ， 导 致其载脂蛋白B的游离氨基琉基化， 这种被琉基化修饰的 L D L，可以不受负反馈抑制地被巨 噬细胞吞噬， 胞内降解增加，引 起胞内 胆固 醇 堆积fzo。 有 研究 认为H cy还可与L D L 反 应形成 琉内 醋 ， 从而 促进 脂 蛋白 沉 积 并 被巨 噬 细 胞 吞 噬 形 成 泡 沫 细 胞 121。 在巨 噬 细 胞中H cy可 通 过 水解从L D L重新释放出来， 并产生自由 基和脂质过氧化产物， 进一步促进A S的形成。 Lent z 等 22 认为H c y 可加强L D L 和自 身 氧化，从而影响N O的 合成和凝 血酶调节蛋白的活性， 导致内 皮功能受损。( 三)降 低H cy的药物1、叶酸和维生素B12如前所述， 叶酸和BI: 是 H cy合成甲 硫氨酸的辅酶， 二者缺乏后， 可以 使血浆总H c 了水平增高， 反之， 若摄入此物质可以降 低几乎所有人的 血浆总H cy， 不管治疗 前 的 总H cy水 平 如 何 123。 B ell a n l y 24 的 研 究 结 果 表 明 口 服叶 酸 可以 改 善 高H cy血症患者内 皮功能， 使内皮依赖性的 血管舒张功能改善。2、维生素B 6口 服维生素B 6 可以降 低大多数病人异常的 血浆总H cy， 若与叶酸合用， 几乎可 使 所 有 人的 血 浆总H cy恢复 正 常。 El lis 25 1 的 研究 提 示 长期口 服可以 延 迟 冠 心病心肌梗死的发生和发展。3、甜菜碱甜菜碱降 低血浆总H cy的 作用与叶酸和B 。 相当或更有效。_暄 鱼些型左丝竺鱼燮逐一一4 、 雌激素替代治疗N as rlz 61 认为 雌激素的作 用机制 也 涉及H cy ， 可能是雌激素增加了肾 脏甲 硫氨酸合酶的活性， 提高甲 硫氨酸的氨基转移作用及使绝经期妇女血清叶酸水平增加有关。 但确切机制仍需进一步研究 证实。H cy使内 皮细胞屏障功能降 低、内 皮依赖的 血管舒张功能失调， 使血细胞更易于 尤其是单核细胞、中 性粒细胞和血小板) 粘附和聚集。内 皮细胞促凝功能 增强， 抗凝和纤溶功能降低，进一步发展可形成动脉粥 样硬化和血栓性疾病。 叶酸、B族维生素和雌激素等通过或部分通过降低血浆同型半肤氨酸而保护血管内 皮， 预防动脉粥 样硬化和血栓性疾病的发生， 但 H cy 对内 皮损伤的分子机制及其涉及的信号传导途径还待进一步研究。二、c ave o l a e 和c ave o l i u 一 1 与内皮功能c ave ol ae和c aveoli o1 广泛地存在于与动脉硬化发展有关的各种类型的细胞中，如内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞。内皮细胞是高水平表达 c avcol in 一 1的细胞类型之一，当 然这些细胞也包含大量的 。 aveo l ae z7 1 。我们将集中阐述c ave o l ae和。 ave o l i n-l 与内皮功能的关系。( 一) c a v e o l a e 和c a v e o l i n 一 1 的 分子组成和结构特点ca ve ol ae ( 微囊) 是细胞质膜表面直径约为50一 100 nln 的凹陷型结构，呈烧瓶状单独或成串出 现， 以内陷的形式连接在细胞质膜上， 呈现典型的脂质双层结构，并且具有高度的疏水性哪 。 c av eol ae广泛的 存在于各种类型的细胞中 ， 在内 皮细胞、 上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、 脂肪细胞中尤为丰富2 9 。 。 av eOl ae是细胞信号传导中心， 与信号传导有关的受体、 激酶及联接蛋白质， 如低密度脂蛋白 受 体(L D L R)、 清道夫受体(s R)、 蛋白 激酶C(P K C)、 G蛋白 等在c aveol ae区域高 度密集， 当配体与受体结合后，c ave ol ae顶端融合酒 己 体一 受体复合物被胞饮入胞 浆内 然 后将信号传入 细胞 核30 1 。 。 av eo l ae主要由 胆固 醇、 糖基 鞘磷脂、 鞘磷脂 及c av e o l 访组成2 口c ave ol in是一个相对分子质量为2124 kD 的完整膜蛋白， 它由N末端区、 跨膜 区 和c 末 端区 组 成 ，N末 端 和c 末 端 均面向 胞 浆 ， 其 肚 链似 发 夹 状 结构。 大 多同型半肌氨酸及叶酸对内皮细胞微囊蛋白一 1 表达的影响数细胞主要表达 ca veol i n 一 1 和 ca veol i n 一 2， 二者形成稳定的异源寡聚体复合物; 而c aveol in 一 3则局限 在肌细胞( 如心肌细胞、 平滑肌细胞、骨骼肌细胞及横纹肌细胞 )， 与 肌 细胞的 合成密 切相关。 用噬菌 体 展示 (P h ag ed i sP l ay 一