DB33 T 538-2005 饲料中卡巴氧的测定 高效液相色谱法

DB33/T ××××2005浙江省质量技术监督局 发布2005-03-18实施2005-02-17发布饲料中卡巴氧的测定 高效液相色谱法Determination of carbadox in feedstuffs High-performance of liquid chromatographyDB33/T 5382005DB33浙江省地方标准ICS 65.120B 46备案号：1DB33/T 5382005前 言本标准在参阅了国外文献资料的基础上，采用净化小柱纯化，再用高效液相色谱仪(配紫外检测器)进行测定。本标准由浙江省农业厅提出并归口。本标准由浙江省饲料监察所负责起草。本标准主要起草人：施杏芬、金海丽、宣士荣、张志健、陈勇、朱聪英、周剑萍。I饲料中卡巴氧的测定 高效液相色谱法1 范围本标准规定了饲料中卡巴氧的测定-高效液相色谱法。本标准适用于饲料中卡巴氧的测定。本标准最低检测浓度为0.5mg/kg。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1 饲料采样方法3 方法原理试样中的卡巴氧先用三氯甲烷+甲醇溶液提取，通过液液萃取、HLB小柱净化，再用甲醇洗脱。以甲醇+水作为流动相，用高效液相色谱仪(带紫外检测器)测定，外标法定量。4 试剂和材料4.1 除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为三级水，色谱用水为一级水，符合GB/T 6682中用水规定。4.2 三氯甲烷。4.3 甲醇(色谱纯)。4.4 氢氧化钠。4.5 氯化钠。4.6 磷酸二氢钾。4.7 (0.1mol/L氢氧化钠+10%氯化钠)混合液： 称取4.0g NaOH和100gNaCl溶于蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1000mL。4.8 1mol/L磷酸二氢钾溶液：称取136 g KH2PO4溶于蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1000mL。4.9 三氯甲烷+甲醇溶液(V+V)=3+1。4.10 色谱净化柱：HLB小柱60mg/3mL。4.11 冰醋酸。4.12 0.45m滤膜：有机滤膜。5 仪器、设备5.1 实验室常用仪器设备。5.2 真空泵(0.1Mpa)。5.3 恒温水浴锅。5.4 旋转蒸发仪。5.5 旋涡混合仪。5.6 超声波提取器。5.7 高效液相色谱仪(配紫外检测器)。6 试样的制备按GB/T 14699.1采样，选取有代表性的饲料样品至少500，四分法缩减至100，磨碎，全部通过0.42孔径分析筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。7 分析步骤7.1 条件检验过程应在避光条件下快速进行。7.2 提取准确称取10g(精确至0.001 g)混匀的试样于250mL锥形瓶中，加2 g左右的硅藻土。在锥形瓶中加入100mL左右的三氯甲烷+甲醇溶液(4.8)，常温超声20分钟，冷却至室温。用60mL玻璃砂芯漏斗(孔径为3)过滤到500mL抽滤瓶中，把抽滤瓶中的滤液倒入另一250mL锥形瓶中；再取40mL三氯甲烷+甲醇溶液（分两次，每次20mL）于有试样的锥形瓶，振摇，抽滤，滤液合并至250mL锥形瓶中。将锥形瓶放于蒸汽浴上，蒸发溶液至近干。加20mL三氯甲烷于棕色锥形瓶把残渣转移至150mL分液漏斗，再用少量三氯甲烷洗涤锥形瓶(2-3次)，洗液合并到150mL分液漏斗。在分液漏斗中加入20.0mL(0.1mol/L氢氧化钠+10%氯化钠)混合液（4.6），振摇2分钟(边振摇边放气)，静置分层，弃去三氯甲烷层。再用三氯甲烷洗涤水相2次，每次用量20mL，洗涤后弃去。加4.0mL 1mol/L磷酸二氢钾溶液（4.7）于水相中，摇匀，备用。7.3 纯化先分别用3mL 甲醇和3mL水对HLB小柱进行活化，取备用液（7.1）5.0mL上小柱，用3mL水淋洗小柱（挤干），加5.0mL 甲醇洗脱(挤干)。收集洗脱液于小试管中(加盖)，旋涡混匀，洗脱液过0.45m 滤膜(4.11)，上机测定。7.4 卡巴氧标准溶液的制备（应现配现用）7.4.1 卡巴氧标准溶液：精确称取20mg卡巴氧标准品(精确至0.00002 g)于100 mL棕色容量瓶中，用三氯甲烷+甲醇溶液常温超声溶解，冷却。用三氯甲烷+甲醇溶液定容并摇匀。此溶液浓度为200g/mL。7.4.2 卡巴氧标准工作溶液：分别吸取贮备液0.1mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0 mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，标准工作溶液系列浓度分别为2g/mL、10g/mL、20g/mL、30g/mL、40g/mL。过0.45m滤膜(4.11)，上机测定。7.5 测定7.5.1 高效液相色谱条件色谱柱：C18 (5m，4.6×250mm)；检测波长：308nm；流动相：甲醇+水=3+7，每1000ml混合液中加2 mL冰乙酸；流速：1.0mL/min；进样体积：20L。7.5.2 上机测定卡巴氧标准工作溶液和试液(上机液)分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积进行计算。7.6 结果的计算与表述7.6.1 计算公式结果按式(1)计算： X=C×V2× (1)×1式中：X-试样中卡巴氧含量，mg/kg；C-试液(上机液)中卡巴氧的浓度，g/mL；V1-试液(上小柱)体积，mL；V2-试液(洗脱液)体积，mL；m-试样质量，g；-稀释倍数。7.6.2 结果表示平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。8 允许差同一分析者对同一试样同时两次测定(或重复测定)所得结果相对偏差不大于15%。 _3