层析 chromatography

生命科学学院：陈晓明(C) 2009层析技术（ 命科学学院：陈晓明(C) 2009一、简介1、层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为 “ 色谱法 ”（ 。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。生命科学学院：陈晓明(C) 20092、层析法是目前广泛应用的一种分离技术，是分离各种生物大分子的主要手段之一， 是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。3、 40年代：两位英国科学家 析）， 他们首先提出了色谱塔板理论， 获得了 1952年的诺贝尔化学奖。由此， 层析技术 成为分离生化物质的关键技术。生命科学学院：陈晓明(C) 20094、按照不同的标准层析法有不同的分类。根据层析峰的位置及峰高或峰面积 ,可以定性及定量。5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。6、在层析法实验技术有 凝胶层析法、离子交换层析法 、高效液相层析法、亲和层析法、聚焦层析法等生命科学学院：陈晓明(C) 2009生命科学学院：陈晓明(C) 2009二、原理及概念层析技术是一类 物理分离方法 ,根据待分离混合物中各组分物理化学性质的差别 ,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中 ,由于各组分随流动相前进的速度不同 ,从而得到有效分离 。生命科学学院：陈晓明(C) 2009基本概念固定相 ：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相 ：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。层析系统都由 两个相组成 ： 固定相与流动相 ，生命科学学院：陈晓明(C) 2009分配系数（ 配系数 是指在一定的条件下（如温度、压力），某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，分配系数是层析中分离纯化物质的 主要依据 ，常用 溶质在固定相中的浓度， 质在流动相中的浓度生命科学学院：陈晓明(C) 2009 示其溶质在固定相中浓度大 ，在洗脱过程中溶质出现较晚 示某溶质在流动相中浓度大，故在洗脱液中出现较早 有相似的 则表明两组分层析峰会发生重叠，分离效果差生命科学学院：陈晓明(C) 2009分配系数主要与下列因素有关： 被分离物质本身的性质 固定相和流动相的性质 层析柱的温度。生命科学学院：陈晓明(C) 2009不同的层析机理，其 吸附层析 中 分配层析 中 离子交换层析 中 亲和层析 中 命科学学院：陈晓明(C) 2009迁移率 （ 是指：在一定条件下 ，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值 。 常用 对迁移率 的概念 。 相对迁移率是指：在一定条件下 ， 在相同时间内 ， 某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比 值 。 常用 晓明(C) 2009分配系数与迁移率的关系 表明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大 之，会减少， 同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分 离的先决条件。其差异越大，分离效果越理想。生命科学学院：陈晓明(C) 2009操作容量 ：在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数（或毫克数）。数值大，结合力强。膨胀度（ ： 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积；即每克溶胀基质所具有的床体积。床体积（ 命科学学院：陈晓明(C) 2009三、分类1、按两相所处状态分类流动相液体 气体液体 液 液层析法固定相 固体 液 固层析法生命科学学院：陈晓明(C) 20092、按层析原理分类名称 分离原理吸附层析法 组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法 各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法 固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离生命科学学院：陈晓明(C) 20093、按操作形式不同分类名称 操作形式柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离薄层层析法 将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法 将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离生命科学学院：陈晓明(C) 2009凝胶层析（ 胶排阻层析（ 子筛层析（ 胶过滤（ 胶渗透层析（ 命科学学院：陈晓明(C) 2009凝胶层析的定义：凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称 凝胶层析 。生命科学学院：陈晓明(C) 2009葡聚糖凝胶（ 丙烯酰胺凝胶（ 脂糖凝胶（ 胶的种类和性质生命科学学院：陈晓明(C) 2009 1. 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（ 指由葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。生命科学学院：陈晓明(C) 2009葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。 也代表持水量 （ 吸水率 ） 乘以 10（ 单位是 mL/ ,如 吸水率是 0依次类推 。 交联度越大 ， 网孔越小 ， 适用于分离低分子质量生化产品 。 交联度越小 ， 网孔越大 ， 适用于分离高分子生化产品 。生命科学学院：陈晓明(C) 2009像 品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成 10种类型。各种类型均以英文字母 000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算），所以数字越大，可分离的分子量也就越大目前。2. 聚丙烯酰胺凝胶生命科学学院：陈晓明(C) 2009琼脂糖凝胶（ 脂糖凝胶 （ 可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子 ， 使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒 ， 其最大范围可达相对分子质量 108。它既具有琼脂凝胶相同的分离区间 ， 又没有吸附作用 。 但其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶 P， 强酸强碱能引起结构破坏 。 最好使用条件控制在 9之间 ， 温度 0 40 。生命科学学院：陈晓明(C) 2009对样品的吸附作用很小琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以 0 30° 晓明(C) 2009二、凝胶层析的基本原理 凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的 凝胶层析的