药监系统官方培训 王知坚 益生菌相关药物的质量分析与控制 浙江省食品药品检验研究院

含益生菌成分药品质量分析现状和相关标准探讨浙江省食品药品检验研究院王知坚浙江省食品药品检验研究院浙江省药品监督管理局直属公益一类事业单位4个国家药品监督管理局重点实验室（药品微生物检测与预警重点实验室）国家级药品包装材料检验中心（浙江省级重点实验室）家级口岸药品检验所、2011协同创新中心核心成员单一期建筑面积23 90m2二期食品检验检测大楼拟建13500m21100余台（套），2亿元260余名，其中高级 称67人，硕士及 以上人员占比超过60%目录12行业现状质量分析现状34国内外法讨质量控制方向1行业现状含益生菌成分 品分类现状含益生菌成分药品10国产含益生菌成分药品42个品种进口含益生菌成分药品10个品种国产药品进口药品42含益生菌药品分类管理情况国药准字Z国药准字B国药准字H国药准字S 共计1个品类 共计1个文号 共计1个品类 共计2个文号 共计13个品类 共计38个文号共计35个品类共计54个文号东三省13家北京5家山东10家前言基本要求制造检定保存、运输及有效期 国药典三部微生态活菌制品总论生物制品含益生药品分中国药典四部通则非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法：除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。应符合制剂通则项下相关标准/微生物限度检查新药转正标准等标准/中药/保健药品分类不同导致执行标准不同计数培性检查法计数方法 用性薄滤法非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法法“培养与计数 点计平板上供试 检查生长的菌落数”结断“培养基上的总菌落数”无法进行合理且符合规定的方法适用性试验非无菌产品微生物限度标准含益生菌成分药品无法满足相关微生物限度标准1.增加稀释液或培养基体积2.加入适宜的中和剂非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查方法适用性试验抗菌活性的或灭活剂去除或灭活3.采用薄 过滤法.上述几种方法的联合使用若未检出试验菌，应 除供试品的抑菌活性 见非无菌产品微生物检査：微生物计需使用抑制益生菌生长但不影响控制菌生长的灭活剂，可操作性低数法(105)中的“抗菌灭活”，并重新进行方法适用性试验。活性的化学药品地标升国标16册白葡萄球菌片含量测定：总磷量、无机磷、有机磷缺少益生菌含量测定相关内容，质量控制存在不足2质量现状分析案例1胰酶散全国全国评评价性抽价性抽验验品种品种复方胰酶散-按化学药品管理的含益生菌复方制剂，活菌来自乳酶生。乳酶生-二部药典收载的 化学原料药管理的益生菌制品，包含活微生物为屎肠球菌。不合格样品：有益生菌，有杂菌。乳酶生0.1g/袋粉酶0.1g/袋胰酶0.1g/袋案例1胰酶散产品：胰酶散（国药准字H13023859）我国1980年开始在各省进行注册生产。曾用名胖得生。现标准为化学药品地标升国标第9册，国外药典无收载。国内共有19家生产企业，20个批准文号。途：用于小儿消化不良及营养障碍应符合中国药典片剂通则下的相关要求。即通则非无菌药品微生物限度标准中相关内容。不合格项目：微生物计数 需氧菌总数（TAMC）霉菌和酵总数（TYMC）案例1胰酶散微生物计数方法适用性：检测条件：1:10供试液，0.2ml/皿，涂布 培养基：TSA、SDA、玫瑰红钠琼脂 测试结果 TSA、SDA上，活菌生长，标准测试菌株回收率大于90%。瑰红钠琼脂上，活菌不生长，标准测试菌株回收率大于90%。案例1胰酶散微生物限度检查结果案例1胰酶散需氧菌总数Max 2000cfu/g霉菌和 母菌总数Max 200cfu/g屎肠球菌6样品Min 10 cfu/g：1234920010 00满足要求4000440045048006900400满足要求满足要求0560050004301400015000440023000600满足要求满足要求满足要求满足要求满足要求满足要求06781009540032003001011121345008004800250059005300满足要求满足要求案例1胰酶散胰酶散中杂菌类别 细菌泛菌属（分散泛菌、septica、alhagi）地衣芽胞杆菌未见较强致病菌，多为分布在空气、环境、土壤中的微生物淀粉芽胞杆菌 霉菌曲霉属（灰绿曲霉、花斑曲霉、赭曲霉、邬氏黄丝曲）出芽短梗霉菌 酵母菌粘质红酵母浅白隐球酵母案例2肠泰合剂 肠泰合剂 制剂概况 生产企业：重庆赛诺 执行标准：WS-11511（ZD-1511）-2002 剂型：合剂，口服液 规格：10ml/支 包装规格：6支/盒，10支/盒 成份：红参、白术、茯苓、甘草、双歧杆菌培养液、陈皮糖浆。儿科消化 良常用药案例2肠泰合剂需氧菌总数序号鉴定结果cfu/ml1234568910111213141516171819202122040505080植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌/11014026077017001900230024003400370062001010 双 歧 杆 菌 严 格 厌 氧 特 性，不干扰需氧条件计数杂菌。样品检出菌=杂菌/101010102/案例2肠泰合剂MRS琼脂培养基（GB4789.35）(ISO 29981-TOS丙酸盐 119#培养基琼脂（企业用）肠泰合剂 双歧杆菌分离检 标准规定：适宜培养基，没有明确。培养条件：37，厌氧袋培养 双歧杆菌属测试菌株生长良好：CC6068、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌 pH3.0的样品环境中，双歧杆菌存在不稳定。2010)蛋白胨 10g牛肉粉 5g酵母粉 4g葡萄糖 20g酪蛋白水解物 10g 大豆蛋白胨 5g/胰蛋白胨 5g酵母粉 10g葡萄糖 10g酵母粉1g/吐温80 1.0mL磷酸氢二钾 2g/磷酸氢二钾4.8g磷酸氢二钾0.04g磷酸二氢钾0.04g/磷酸二氢钾 3gL-半胱氨酸盐酸盐 0.5g丙酸钠15g半胱氨酸盐酸盐0.5g醋酸钠 5g当采取GB及ISO推荐的培养基检查时，23批肠泰合剂中均未分离到双歧杆菌活菌。柠檬酸三铵 2g硫 铵3g氯化镁 0.0192g硫酸镁 0.2g硫酸锰 0.05g硫酸镁 0.2g/低聚半乳糖混合物 10g琼脂 15氯化钙 0.008g碳酸氢钠 0.4g/氯化钠 0.08g琼脂 15g水 1000mLpH 6.2琼脂 1520g水 1000mLpH7.0水 1000mLpH6.3案例2肠泰合剂出处种标准收录 中成药品种，WS-11511(ZD-1511)-2018修订内容中未涉及微生物内容。/属双歧杆菌属双歧杆菌科双歧杆菌目放线菌纲 2004版标准，2018版标准中并未明确生产菌种的种名，只标称双歧杆菌。科目 企业对于菌 的生产过程控制意识不足。2019年 企业联系相关专业领域进行生产调整。纲门放线菌门案例3复合乳酸菌胶囊 104批样品中均存在鼠李糖乳杆菌和屎肠球菌。随着室温放置时间延长，菌数不断下降。样品检出伯杰氏手册伯杰氏手册胶囊标准收录胶囊标 样品检出 胶囊标出处1984年乳酸乳杆菌重命名准收录（小菌落）准收录 乳酸链球菌（大菌落）重命名种属德氏乳杆菌乳酸亚种乳酸乳球菌乳酸亚种乳杆菌嗜乳杆菌 鼠李糖乳杆菌 乳酸链球菌屎肠球菌乳杆菌属乳杆菌科链球菌属 乳 菌属 肠球菌属链球菌科 肠球菌科科目纲门乳杆菌目芽孢杆菌纲厚壁菌门案例3复合乳酸菌胶囊 企业、三部微生态制剂 药典委员会进行标准协调。2019.1公示的标准中，修订了菌种名称，增订了“杂菌”检查的要求。3国内外法规探讨中国药典中国药典2015年版三部，包含：前言 基本要求 造 检定 保存、运输及有效期附录1 已批 上市的微生态活菌制品附录2 微生态活菌制品活菌数测定方法附录3 微生态活菌制品杂菌检查法中国药典杂菌检查法（计数及控制菌 查）种子批到成品的检定活 数测定方法种子批的检定：生化反应：按通则3605“细菌生化养基”选择相应的培养基或其他事宜方法进行，结果应符合原始菌种的特性。选择性琼脂培 基是指最适宜制剂（或菌粉）中活菌生长的培养基。须经批准后方可使用。控制菌检查 定性测定产品中 否污染特定致病菌或者条件致病菌；非致病性杂菌 定量测定产品中污染的杂菌；真菌计数 定量测定产品中污染的真菌；培美国药典64 PROBIOTIC TESTSIDENTIFICATION ENUMERATION PERFORMANCE TESTS CON AMINANTS ADDITIONALREQUIREMENTS美国药典菌种鉴定程序不产芽孢菌的鉴定法：用特异性引物鉴定乳酸菌和双歧杆菌美国药典活菌计数目前，本章收载了乳酸菌和双歧杆菌的计数方法。其他益生菌株的计数方法，入芽孢菌、非芽孢菌、酵母菌或霉菌后续也将在本章中收载。也可采用其他微生物替代方法进行计数试验，与USP接轨，一些新技术及替代方法也可被用于活菌计数只要证明是等效的。美国药典欧洲药典 LIVE BIOTHERAPEUTICPRODUCTS FOR HUMAN USE 2.6.36.MICROBIOLOGICALEXAMINATION OF LIVEBIOTHERAPEUTICPRODUCTS:TESTS FORENUMERATION MICROBIALCONTAMINANTS 2.6.38.MICROBI LOGICALEXAMINATION OF LIVEBIOTHERAPEUTICPRODUCTS:TESTS FOR SPECIFIEDMICRO-ORGANISMS欧洲药典特征鉴定包括确定该菌株的表型和基因型，采用宏观和微观方法、生测试、分子遗传学测试、测序或质谱分析。株水平的鉴定欧洲药典通过适当的微生物计数试验，以CFU为单位来确定活性微生物数量。果以CFU/g、CFU/mL或CFU/unit示；应不小于规定值或在规定的范围内。经批准，可以活细胞数/mL表示。活菌计数方法应经相应的方法适用性试验欧洲药典杂菌计数检查法，若活菌生物制剂（LBP）会干扰杂菌计数，则可按照右图进行优化。合理且验证的其他方法也可被使用。欧洲药典控制菌检查采用2.6.6已验证的方法消除活菌或 他物质的影响，如仍有干扰，则根据右图所示进行优化。欧洲药典若杂菌检查方法不适用，则采取检测是否存在特定的致病性微生物来代替杂数试验。欧洲药典菌株必须具有稳定的表型和基因型。菌株的抗菌素耐受性明确，任何可能从某种微生物转移到相关微生物菌群 耐药性须进行调查和排除。在安全性方面，必须对毒力因子的存在进行调查和评估。对菌株安全性的要求与中国药典三部微生态活菌制品总论基本一致食品、保健食品相关法规联联合于合于2012年年1月月3日提出用作食品成分的益日提出用作食品成分的益生菌推荐生菌推荐标标准，并将其包括在新的附准，并将其包括在新的附录录 XV 中中细菌17个属酵母15个属35个属个属真菌3 个属美国USP及FCC食品、保健食品相关法规鉴定菌数配套相关的标准规范进行约束安全性标签与效力美国监管机构运行模式活性与遗传稳定性纯度定期更新备案信息和标准方法国际保藏/参考菌株株传代程序采用“企业备 制”运输和贮存美国USP及FCC食品、保健食品相关法规EFSA建立安全资格认证QP，对添加到酵母11属14种食品中的微生物实施上市前风险评估细菌15属74种通过安全资质认证的益生菌菌株88种EFSA（欧洲食品安全局）2016版食品、保健食品相关法规分类学地位：通常要求其鉴定到种水平QPS菌种相关信息：使用历史，科学文献，临床工业应用，生态学及其他适当因素估内容致病性：不具产毒特性最终用途EFSA（欧洲食品安全局）2016版食品、保健食品相关法规不得携带临床用抗生素的耐药性基因获得性耐药基因包括但不限于以下36种tetvanDaphvatbla V ManEaadbla KPCvanGarmbla CTX-MvanLrmtvanAvanMermvanBaaclnuvgaeremefmremsrmphcatlinlsacfruldhfrfloflexqepqnoqxAB食品、保健食品相关法规否分分类类地位明确地位明确是知知识识体系完善体系完善是否计计划用途