TIMP4基因的克隆、原核表达及活性测定
TIMP-4基因的克隆、原核表达及活性测定【摘要】目的:采用RT-PR法获取TIP-4基因,并通过原核表达获取具有生物活性的TIP-4交融蛋白。方法:从SD大鼠心肌组织中提取总RNA,利用RT-PR法扩增出TIP-4基因,经基因序列分析后构建表达载体PET-28a(+)-TIP-4,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导TIP-4的表达。利用N2+-NTA纯化和复性后,根据其骨肉瘤细胞迁移才能的影响检测其活性。结果:克隆到编码序列完全正确的大鼠TIP-4基因,能在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物占全菌总蛋白的23.5%,N2+-NTA纯化和复性后,纯度达90%以上。纯化后的交融蛋白使骨肉瘤细胞株的迁移才能得到显著抑制。结论:通过基因克隆和原核表达的方式可以大量获得具有生物活性的TIP-4交融蛋白。【关键词】TIP-4基因克隆基因表达免疫活性Abstrat:bjetive:TextratthegenefTIP-4ithRT-PRethdsandbtainthebiativeratTIP-4fusinprtEinexpressedinE.li.ethds:TtalRNAasextratedfrardiauslefSDrat.TIP-4geneasbtainedandaplifiedithRT-PRethd.Theislatedfragentassequened,rebinedithplasidpET-28a(+)atERIandHindsitesandtransfredintE.liells.TheexpressinfTIP-4asinduedbyIPTG.TIP-4prteinaspurifiedandrenaturalizedbyN2+-NTA.Theapabilityfinhibitingigratinfstesaraelllineasusedasaeasuretassayitsviability.Results:TheTIP-4geneftherat,hihaslnedandrretlyded,uldbehighlyexpressedintheE.listrain.TheexpressedprdutftheTIP-4auntedfr23.5%fthettalbaterialprtein.TheTIP-4auntedfratleast90%afterN2+-NTApurifiatin.ThepurifiedTIP-4prteinuldsignifiantlyinhibittheigratinfstesaraellline.nlusin:TIP-4fusinprteinithbiativityanbebtainedprfuselybygenelningandexpressininE.li.Keyrds:TIP-4;genelne;expressin;viabilityassay目前对恶性肿瘤的治疗尚缺乏非常有效的措施,其主要原因在于肿瘤具有侵袭、转移和基因变异等特性,对肿瘤侵袭转移机制方面的研究成为肿瘤治疗的关键。组织基质构造的破坏和肿瘤新生血管的形成是肿瘤生长、转移得以实现的先决条件。基质金属蛋白酶atrixetallprteinase,P为一类蛋白水解酶家族,它能降解多种胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白等血管基膜和基质构造,为肿瘤的生长、转移创造适宜的环境。金属蛋白酶组织抑制剂tissueinhibitrfatrixetallprteinase,TIP的发现是肿瘤研究上的一大打破,它是P的天然抑制剂,目前根据发现的时间顺序分别称为TIP14。国内外对于TIP-4的功能已经有了一些研究,但结果有所差异。Jiang等1的研究发现,TIP-4可以抑制乳腺癌细胞的凋亡,而更多的实验说明TIP-4为肿瘤生长的抑制因素2,3。为进一步开展对TIP-4在骨肉瘤和软骨肉瘤方面的作用及其机制的研究,以及对其在其他领域的功能,本实验采用分子生物学的基因克垄表达和纯化等手段,力求获取具有生物活性的TIP-4交融蛋白,为以后的研究打下基矗1资料和方法1.1材料1.1.1组织来源:成熟SD大鼠由第二军医大学实验动物中心提供。1.1.2菌种、质粒和细胞:大肠杆菌TG1、BL21(DE3)、pBluesriptSK(+)质粒、表达质粒pET-28a(+)均由第二军医大学神经生物学教研室提供。骨肉瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生化研究所。1.1.3试剂:RNA抽提试剂盒为上海化舜生物工程产品。RT-PR试剂盒为Qiagen公司产品。PyrbestDNA聚合酶为Takara公司产品。限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶为BI公司产品。质粒抽提和胶回收试剂盒为Vigene公司产品。异丙基-D-硫代半乳糖苷酶IPTG为上海生工公司产品。Ni2+-NTA柱为Siga公司产品。1.2方法1.2.1RT-PR1.2.1.1总RNA的提取:取成熟SD大鼠心肌组织约150g,参考萨姆布鲁克等4方法及RNA抽提试剂盒手册,电动匀浆后行总RNA的提龋1.2.1.2DNA的合成:参考RT-PR试剂盒实验手册进展。RNA(1g/l)2.0l,dNTPs(5dNTP)2.0l,lig-dT引物10unit/l1.0l,RNase抑制剂10unit1.0l,逆转录酶4unit1.0l,无RNase水加至20l。37温育60in,然后90温育5in使逆转录酶失活。-20保存。1.2.1.3PR扩增:参考GeneBank(gi:48255910)发表的序列及表达载体pET-28a(+)多克隆位点、应用DNAstar软件设计引物,由上海生工公司合成。上游引物:5'TGGAATTATGTGGGAGT3'ERI下游引物:5'GAAAGTTGATATTGGTATG3'HindIII取逆转录产物2.0l为模板,按常规PR反响条件,先将样品于94变性5in,参加2.5u的PyrbestDNA聚合酶,按以下参数循环35次:94变性1in,58退火1in,72延伸40s,最后一个循环后,72延伸10in,4保存。1.2.3载体的构建及DNA序列分析:将RT-PR产物平端与用ER酶切过的pBSK(+)质粒,回收后转化大肠杆菌TG1,挑白斑培养抽提质粒并进展初步酶切鉴定,选择3株酶切合格质粒送生工公司测序。把测序正确的质粒用ERI和Hind双酶切,胶回收后与预先经ERI和Hind双酶切的表达载体pET-28a(+)在连接酶作用下相连接,构建T7启动子控制下的TIP-4表达质粒见图1。将pET-28a(+)-TIP-4表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。1.2.4重组克隆的诱导表达、纯化和复性及鉴别:将pET-28a(+)-TIP-4表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),接种单菌落至3lLB培养液中37培养过夜,按2%的比例转接于LB培养液中含50g/l的卡那霉素,37培养至A600条件下为0.61.0,参加IPTG终浓度为1/L,诱导35h,离心搜集菌体,进展SDS-PAGE蛋白电泳,薄层扫描检测TIP-4的表达情况。诱导表达菌经超声破碎后,搜集包涵体,用洗涤缓冲液洗涤,500l菌液制备的包涵体溶于20l溶解缓冲液。溶解后的蛋白用结合缓冲液透析24h后进展纯化。由于TIP-4的N端交融了6×His,所以表达产物以Ni2+-NTA树脂来纯化。溶解的蛋白上预先以3倍柱体积结合缓冲液平衡的Ni2+-NTA柱后,先以10倍结合缓冲液洗涤,再分别以10倍柱体积的NTA-PH6.5Buffer和NTA-PH5.80Buffer洗脱杂蛋白。直接在Ni2+-NTA柱上复性5。先用10倍柱体积的复性缓冲液A洗涤,再用15倍柱体积的复性缓冲液B洗涤。最后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。纯化的TIP-4经蛋白质浓度测定后,-70保存。esternblt分析鉴别:用10%丙烯酰胺凝胶进展SDS-PAGE电泳(每孔加TIP-4纯化交融蛋白20l),电泳后将蛋白转移至硝酸纤维膜上,切取条带后在4条件下以的TIP-4单克隆抗体(1:100Siga)孵育24h,漂洗后以带有辣根过氧化物酶的二抗37孵育30in,4-氯-1-萘酚Siga显色。1.2.5实验操作方法:质粒抽提、酶切反响、DNA片段回收、连接反响、细菌转化、SDS-PAGE电泳等实验操作均参照文献4略加修改良行。1.2.6TIP-4蛋白对骨肉瘤细胞侵袭性影响的测定(微孔迁移技术):Byden小室的构建参照hyeldinA等6方法。用DE制备浓度为2×105个/l的骨肉瘤细胞悬液,分成两组:1组为对照组,另1组含浓度为20g/l的TIP-4蛋白,向小室中各参加细胞悬液100l,37孵育24h后将小室置于4%中性甲醛中固定20in,存在于微孔滤膜上面的细胞用棉签蘸95%乙醇轻轻擦去,侵袭至膜下的细胞用苏木精和5%结晶紫染色,膜枯燥后用剪刀将膜剪开,置于玻片上中性树胶封片并计数,每张膜取上、下、左、右、中5个视野,取均数,每种处理分别重复3次。取穿过膜的细胞相对数作为衡量细胞侵袭才能的指标,计算方法为:侵袭力=1-实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数×100%。1.3统计学处理方法采用t检验进展统计检验。2结果2.1TIP-4基因的获得新生4dSD大鼠心肌细胞组织总RNA,经甲醛变性电泳,紫外检测仪下可见完好的28s,18srRNA,说明提取的总RNA质量可靠,未出现降解。RT-PR扩增得到大小约680bp的特异条带,大小与预测结果一致见图2。回收此片段平端克隆入载体pBSK(+),转化感受态TG1,挑取重组子,经ERI和Hind双酶切鉴定,琼脂糖电泳见图3,说明插入片段大小与预测大小一致。对重组质粒中插入片段测序,结果说明别离的TIP-4基因序列与GeneBank(gi:48255910)发表的序列一致。2.2TIP-4的诱导表达、纯化及复性采用IPTG诱导表达后发现,在分子量约23kD处有显著的蛋白表达条带,该蛋白大小与理论计算值根本一致,凝胶自动扫描分析显示,其占BL21细菌总蛋白的23.5%,根本是以包涵体形式存在。将大量诱导的BL21细菌超声破碎、洗涤、溶解、纯化、复性后,经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色分析,除TIP-4特异条带外,根本无其他条带,薄层扫描结果可见纯度达90%以上,详见图4、图5。经过esternblt分析后显示所获得的蛋白质与TIP-4抗体具有特异性作用,为TIP-4蛋白见图6。2.3TIP-4的活性测定atrigel经过重建后在聚碳酸酯膜外表形成类似天然基底膜构造,对其的侵袭才能可以显示出肿瘤细胞的侵袭力。本研究中显示,TIP-4交融蛋白使骨肉瘤细胞侵入基底膜才能受到明显影响,浸入的细胞数为61.3±5.2对照组为80.5±7.6,其抑制率到达25.1%(见表1)。3讨论TIP-4是1996年JhnGreene等7采用已表达序列标志(expressedsequenetag,EST)序列测定的方法研究P的抑制物TIP时发现的,属于TIP家族成员中的一员,根据发现的先后顺序而被命名为TIP-4。后来通过免疫组化、Nrthen-Blt,RT-PR及原位杂交等方法来研究发现,TIP-4的组织表达相当局限,在肾脏、胰腺、结肠及直肠中的表达量非常低,在肝脏、脑、肺、甲状腺、小肠等组织中根本无表达,但在心脏有大量的转录和翻译。鉴于此,我们选择用成熟SD大鼠的心肌细胞作为基因的组织来源,参考GeneBank(gi:48255910)发表的序列,应用DNAstar生物软件设计引物,用RT-PR方法别离到了TIP-4目的