ifs转基因大豆的鉴定及高异黄酮植株的筛选

IFS 转基因大豆的鉴定及高异黄酮植株的筛选 祁延萍 刘雅婧 许乐义 王凌妍 朴哲主 崔光赫 闫帆 王庆钰 吉林大学植物科学学院 摘 要： 大豆异黄酮是一种广泛应用的保健性活性物质, 近年来已成为衡量大豆品质的重要指标之一。异黄酮合酶是大豆异黄酮合成途径中的关键酶基因之一, 其在植物中的表达效率直接影响异黄酮含量。为进一步验证该基因的功能并获得高异黄酮稳定遗传转基因植株, 本试验基于已有的 IFS 转基因材料开展研究。将其扩繁至 T2 代, 考种分析植株农艺性状, 发现转基因植株的性状指标未发生明显变化, PCR 鉴定 IFS 转基因后代的结果显示:在 125 株转基因植株中, 60 株为阳性, 占比 48%, 说明 IFS 在后代中可稳定遗传。选取 IFS 转基因吉林35、Willimas 82 品种 T2 代的 41 株, 利用改良后的三波长法测定籽粒中大豆异黄酮的含量, 结果显示:IFS 转基因植株的平均异黄酮含量为 1.2 mg·g-1;其中 15 株的异黄酮含量高于非转基因植株, 占比达到 36.6%, 说明从转入 IFS 基因转基因大豆能够筛选出高异黄酮植株。本研究获得了稳定遗传的高异黄酮植株, 为大豆遗传育种提供优异的种质资源;改良后的三波长法较原有方法更为精准、快速。关键词： 大豆; IFS; 异黄酮含量; 三波长法; 作者简介：祁延萍 (1995-) , 女, 学士, 主要从事大豆分子育种研究。E-mail:qiypmails.jlu.edu.cn。作者简介：王庆钰 (1963-) , 女, 博士, 教授, 主要从事基因工程在育种上的应用与植物杂种优势的理论及其应用研究。E-mail:qywangjlu.edu.cn。收稿日期：2017-04-27基金：吉林大学大学生创新创业训练计划 (2015821253) Identification of IFS Transgenic Soybean and Selection of Plant with High IsoflavonesQI Yan-ping LIU Ya-jing XU Le-yi WANG Ling-yan PIAO Zhe-zhu CUI Guang-he YAN-Fan WANG Qing-yu College of Plant Science, Jilin University; Abstract： As a healthy active substances, soybean isoflavones have obvious effects in the prevention of cancer, osteoporosis, cardiovascular disease and women's climacteric syndrome.IFS is one of the key enzymes in the pathway of isoflavone biosynthesis and it had a positive effect on the content of isoflavones in soybean seeds, but we still haven't get stable and efficient transforms.Therefore, it is very important to improve the content of soybean isoflavones by studying isoflavone synthase pathway.In this study, after propagating IFS transgenic plants to T2 generation, physiological indexes in transgenic plants had no obviously changes by agronomic traits analyzing.After identifying IFS transgenic soybeans by RT-PCR analysis, there were 60 IFS transgenic soybeans in 125 plants, accounting for 48%.This result indicated that IFS was stablily inherited in offspring.We used the modified three wavelength method to measure the isoflavone content and results showed that the average isoflavone content was 1.2 mg·g-1 in IFS transgenic plants.Among the 41 IFS positive plants, isoflavone content of 15 individual plants were higher than that of the non-genetically modified plants, which accounted for 36.6%.The IFS had a certain effect on the improvement of isoflavone content and it is possible to select plants with high isoflavones in IFS transgenic soybeans.This study clarified the effect of IFS on the content of isoflavones in transgenic soybean and obtained transgenic soybean containing much soybean isoflavones and provided an excellent germplasm resource for soybean breeding at the meantime.In additionally, the improved three wavelength method was more accurate and faster.Keyword： Soybean; IFS; Isoflavone content; Three wavelength method; Received： 2017-04-27大豆异黄酮是从大豆中提取的一种生物活性物质, 主要分布于大豆的种皮、胚轴和子叶中1, 被称为天然植物雌激素2, 在预防心血管疾病、预防骨质疏松、抗肿瘤和抗癌等方面具有重要的作用3, 还能有效改善更年期妇女综合征4, 近几年已成为衡量大豆品质的重要指标之一。异黄酮的合成源自黄烷酮合成途径中的中间代谢产物, 而异黄酮合酶 (isoflavone synthase, IFS) 在黄烷酮代谢途径转入异黄酮代谢途径中起了关键作用5-6, 它是该转换过程中的第一步反应酶, 迄今已在各种植物中发现了近百种由 IFS 酶催化而来的异黄酮化合物, 主要有染料木素、大豆苷元和黄豆黄素以及它们的糖苷衍生化合物。如今随着生活水平的不断提高, 人们越来越重视健康, 大豆异黄酮也被广泛作为保健类活性物质。以往大豆异黄酮的研究与开发主要以加工提取为主, 产品多为药物中间体, 供特殊人群保健需要, 很少从提高大豆中异黄酮含量的生物学角度入手, 从食物源头来提高异黄酮含量, 进而预防疾病发生。随着分子生物学研究的发展, 近年来, 已经有很多通过转化单个酶基因来提高异黄酮含量的报道, 但转基因大豆异黄酮表达的高效性和稳定性还有待进一步研究。本试验基于研究室前期已获得的 IFS 转基因材料, 研究了 T2代转基因植株的农艺性状表现、转 IFS 基因的遗传, 用优化的三波长法测定阳性转基因植株中异黄酮的含量, 以期获得高异黄酮含量且稳定遗传 IFS 转基因大豆。1 材料与方法1.1 材料供试大豆品种为吉林 35 和 Willimas 82 的 IFS 转基因材料。吉林 35 是吉林省农业科学院大豆研究所育成的高脂肪型中熟大豆新品种, 生育期 126d, 适宜在10有效积温 2 7002 900以上地区种植。质粒 p CB35SR1R2GFP-IFS2, 含 Bar 基因。以上材料均由吉林大学植物科学学院植物种质资源与利用研究室提供。主要试剂:三波长测定异黄酮含量所需的染料木苷 (美国 sigma 公司) , Taq 酶和 PCR 所需试剂 (TAKARA 公司) , 国产分析纯无水乙醇 (北京化工厂) 。1.2 方法1.2.1 转基因植株大田扩繁T2代种植:共 3 个株系, 编号为 S1 (吉林 35) 、S2 (吉林 35) 、S3 (Willimas82) 。于 2016 年 5 月 9 日在吉林大学试验田进行单粒点播, 株距 20 cm, 行间距 20 cm。其中 S1、S2 和 S3 株系分别播种 40, 35 和 50 粒, 共计 125粒种子。1.2.2 IFS 转基因大豆鉴定利用 Primer Premier 5 设计引物, 用于鉴定阳性转基因植株的引物根据 Bar 基因序列设计, 上游引物序列为:5'-AAAC-CCACGTCATGCCAGCTC-3'下游引物序列为:5'-CGACAAGCACGGTCAACTTC-3', 扩增片段长度为 417 bp。其次用 CTAB 法提取 T2代 IFS 转基因大豆的总 DNA, 然后通过 PCR 来鉴定 T2代 IFS 转基因大豆, PCR 反应体系为:10×buffer (Mg) 2.5L, d NTP 2L, 正义引物 1L, 反义引物 1L, DNA 模板 1L, DNA 聚合酶 0.3L, 加 dd H2O 至总体积25L。PCR 条件:94预变性 10 min;94变性 50 s, 60退火 50 s, 72延伸 30 s, 共 30 个循环;72延伸 10 min, 4保存。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳 EB 染色后, 在凝胶成像仪下观察条带。1.2.3 转基因植株农艺性状调查2016 年 9 月分别统计各扩繁后代株高、分枝数、单株荚数、绒毛颜色等农艺性状。挂写标签, 单株收获, 悬挂于种子挂藏室。收获后对晾干的植株进行单株考种。单株脱粒过程中完成对种皮颜色、种脐颜色、粒数的统计, 然后用天平称量粒重, 并计算百粒重。此后, 通过近红外谷物综合分析仪测定 T2代植株的蛋白质和脂肪含量。1.2.4 三波长法测定异黄酮含量基于本实验室前期研究者张艳等7三波长测定异黄酮的基础, 综合鞠兴荣等8、王哲等9、赵健如10的理论方法, 将超声波法提取异黄酮改良为水浴锅加热法提取, 并且保持料液比为 120, 测定异黄酮含量。1.3 数据分析采用 Excel 2013 进行数据统计。2 结果与分析2.1 T2代转基因阳性植株的鉴定T2代种植 125 株转 IFS 基因植株, 108 株成熟并收获, 经 PCR 鉴定阳性植株有60 株 (表 1, 图 1) 。其中 S1 株系种植 40 株, 最终收获 33 株, 其中阳性植株20 株;S2 株系种植 35 株, 最终收获 28 株, 阳性植株 14 株;S3 株系种植 50 株, 收获 47 株, 有 26 株呈阳性。图 1 IFS PCR 产物电泳图谱 Fig.1 Electrophoresis patterns of IFS PCR product 下载原图M:DNA 分子量标准;15:部分阳性 IFS 转基因植株样品;6:阳性对照 (质粒) ;7:阴