epec粘附素intiminc280抗血清的制备及其中和能力测定
EPEC 粘附素 IntiminC280 抗血清的制备及其中和能力测定 康迁 黄荣 冯亚岚 皮光环 杨健 川北医学院附属医院儿科 川北医学院基础医学院病原生物学与免疫学实验教学中心 摘 要： 目的 制备 EPEC 粘附素 IntiminC280 抗血清, 检测其中和 EPEC 对 Hep-2 细胞粘附作用。方法 用基因克隆技术构建 IntiminC280 表达载体 pET32 () -intiminC280, 转化表达宿主菌 BL21, 用 IPTG 诱导 His-IntiminC280 融合蛋白的表达, SDS-PAGE 分析其表达形式;用 NI 柱亲和层析法纯化融合蛋白, 并辅以佐剂免疫家兔, 4 次免疫后采血, 分离血清, 对流免疫电泳法检测抗血清效价;以该抗血清作为一抗, 采用 Western blot 检测 EPEC 粘附素 Intimin 的表达;用不同稀释度的抗血清中和 EPEC, 显微镜下观察细菌被中和后对 Hep-2 细胞的粘附情况。结果 成功构建 BL21/pET32 () -intiminC280 原核表达系统, 表达蛋白的分子质量单位为 50ku, 与预期相符。用纯化的 His-IntiminC280 免疫家兔获得高效价抗血清, 16 倍稀释后仍能有效抑制 EPEC 对 Hep-2 细胞的粘附。结论 IntiminC280 抗血清具有抑制是 EPEC 粘附 Hep-2 细胞作用, 可作为 EPEC疫苗研发的备选抗原。关键词： 肠致病性大肠埃希菌; 紧密素; 抗血清; 粘附; 作者简介：杨健, E-mail:jiany74163.com作者简介：康迁 (1989-) , 女, 四川达州人, 在读研究生, 主要从事肠道病原体的研究。E-mail:412113908qq.com收稿日期：2017-06-17基金：四川省教育厅项目 (No.15ZA0205) Preparation of antiserum against IntiminC280 (an EPEC antigen responsible for adhesion) and examination of its neutralization abilityKANG Qian HUANG Rong FENG Ya-lan PI Guang-huan YANG Jian Pediatrics, North Sichuan Medical College Hospital; Experimental Teaching Center for Pathogens and Immunology, School of Basic Medical Sciences, North Sichuan Medical College; Abstract： Objectives To prepare antiserum against IntiminC280 (an EPEC antigen responsible for its adhesion) and to observe whether the antiserum could affect the adhesion of EPEC to Hep-2 cells. Methods The IntiminC280 expression plasmid pET32 () -intiminC280 was constructed using gene cloning and transformed into the host strain BL21.Expression of the His-IntiminC280 fusion protein was induced with IPTG and that expression was analyzed with SDSPAGE.The fusion protein was purified with Ni column affinity chromatography and the purified protein was used to immunize rabbits with adjuvants.After 4 immunizations, serum was collected and the antiserum titer was measured using a convective immunoassay.The antiserum was used to recognize the expression of EPEC Intimin in Western blotting.The adhesion of EPEC to Hep-2 cells was observed after EPEC was neutralized with different dilutions of antiserum. Results A BL21/pET32 () -intiminC280 prokaryotic expression system was constructed, the molecular weight of the expressed protein is 50 ku, which is consistent with expectations.A high-titer antiserum against IntiminC280 was obtained and the adhesion of EPEC to Hep-2 cells was inhibited by the antiserum up to a dilution of 16. Conclusion IntiminC280 antiserum inhibits the adhesion of EPEC to Hep-2 cells and IntiminC280 can serve as an ideal antigen for EPEC vaccine research.Keyword： EPEC; Intimin; antiserum; adhesion; Received： 2017-06-17肠致病性大肠埃希菌 (Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC) 是引起发展中国家婴幼儿腹泻的主要病原体之一1。EPEC 感染宿主后在肠粘膜细胞产生特征性病理变化-粘附脱落损伤 (attaching and effacing lession, A/E 损伤) 2, 导致肠道吸收能力下降, 引起腹泻。A/E 损伤涉及染色体上一个长约35kb 的毒力岛 (pathogenicithy island, PAI) 3, 该毒力岛分布有 EPEC 致病基因, 包括编码多个毒力相关的效应蛋白和一个 III 型分泌系统 (type III secretion system, T3SS) 4, T3SS 将一系列效应蛋白转移至宿主细胞, 触发肌动蛋白聚合, 形成基垫5, 有利于细菌紧密粘附, 同时细菌通过 Intimin (紧密素) 与其易位受体 Tir (Translocated intimin receptor, 转位紧密素受体) 结合形成的 Intimin-Tir 复合物, 将细菌锚定在宿主细胞6。Intimin是 EPEC 毒力发挥的重要分子之一, 是一种细菌外膜蛋白。研究表明 Intimin 及其受体 Tir 在 EPEC 感染导致细胞线粒体的功能障碍中起重要作用7。Intimin参与细菌的粘附及其对宿主细胞的损伤, 即与 EPEC 的致病性有关。目前, 研究多集中在 EPEC 的毒力因子及其致泻机制方面, 对其毒力因子的体外中和能力的研究鲜有报道。本研究拟通过构建 BL21/pET32 () -intiminC280 原核表达系统, 用 IPTG 诱导表达, 表达产物纯化后作为抗原免疫家兔, 制备 Intimin 抗血清, 观察抗血清的中和能力, 判断 Intimin 是否为 EPEC 感染的保护性抗原, 为 EPEC 疫苗研究提供理论基础。材料与方法1 材料1.1 菌种、质粒和实验动物EPEC E2348/69, 大肠埃希菌 BL21、质粒 pET32 () 及 Hep-2 细胞由川北医学院分子生物学与免疫学研究所保存;新西兰大白兔由川北医学院动物中心提供。1.2 主要试剂高保真 PCR 扩增试剂盒、限制性内切酶 BamH I、Hind III、DNA (DL2000) marker 和蛋白质分子量标准购于大连宝生物公司;IPTG 购于北京索莱宝公司;SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒购于博士德生物公司;Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒购于北京康为世纪公司;BCA 蛋白浓度测定试剂盒, DAB 显色剂和 DAPI 染料购于碧云天生物;醋酸纤维膜 (NC 膜) 购于美国 MILLIPORE 公司;抗-His 抗体及山羊抗小鼠 IgG 购于北京中杉金桥;DMEM 培养基购于美国 Invitrogen 公司;胎牛血清购于成都哈里生物有限公司, 引物 1 (5'-TCGGATCCATTACTGAGAT-TAA-3') , 引物 2 (5'-CGAAGCTTCGGACAAT-GATTAG-3') 由上海生物技术有限公司合成。2 方法2.1 质粒 pET32 () -intiminC280 的构建及鉴定以 EPEC E2348/69 为模板, 用 PCR 方法扩增 intiminC280 基因片段。PCR 体系:10×PCR 扩增缓冲液 (Mg) 10l, dNTP (各 2.5mmol/L) 8l, 引物 1 和引物2 各 1l, EPEC 菌液 1l, LA 聚合酶 0.5l, 灭菌水 28.5l。扩增条件:94预变性 2min;94变性 30s, 55退火 30s, 72延伸 1min, 共 30 个循环;72终延伸 5min。胶回收 PCR 产物, 用 BamH I 和 Hind III 双酶切 PCR 产物, 回收的酶切产物与同样酶切的质粒 pET32 () 片段于 4连接过夜, 连接产物转化感受态细胞 TOP10, 用 100mg/L 的氨苄青霉素筛选, 挑取克隆进行酶切鉴定和测序鉴定。2.2 BL21/pET32 () -intiminC280 原核表达系统的构建、蛋白表达及纯化用热激法将重组质粒 pET32 () -intiminC280 转入表达菌 BL21 中。进行培养。挑取阳性克隆接种至含 100mg/L 氨苄青霉素的 LB 培养基中, 37、220r/min扩大培养 3h 后, 加入 IPTG (终浓度为 1mmol/L) 诱导培养 4h, 5 000r/min (离心半径 13.5cm) 离心收集菌体, 超声破菌, 10 000r/min (离心半径 13.5cm) 离心 30min, 分别收集沉淀和上清, 通过 SDS-PAGE 电泳分析 IntiminC280 的表达形式, 采用 NI 柱亲和层析法对目的蛋白进行纯化, 按说明书步骤操作。2.3 IntiminC280 抗血清制备取纯化目的蛋白 1mg 与等体积佐剂乳化后对家兔进行背部多点皮下注射免疫 4次, 末次免疫后 1 周心脏采血, 分离血清, 采用对流免疫电泳检测抗血清效价。2.4 Western blot 检测 Intimin 的表达过夜培养的 EPEC 重组菌用上样缓冲液悬浮并煮沸 10min, 进行 SDS-PAGE 电泳并转膜。用 5%脱脂奶粉封闭 NC 膜 1h, 洗涤加入 150 稀释的抗血清于 37结合 1h, 洗涤;加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗 (12 000) 结合 1h, 洗涤;加入底物 BCIP/NBT 闭光
