包头医学院微生物学与微生物检验实验指导之实验7 铜绿假单胞菌的检测

实验7 铜绿假单胞菌的检测目的要求1、 掌握铜绿假单胞菌检测的主要步骤与方法。2、 熟悉化妆品标本的采集原则。3、 掌握铜绿假单胞菌菌落的观察和生化反应结果的判断。器材和试剂1样本 可疑化妆品2培养基及试剂 SCDLP液体培养基、普通营养琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯平板、KIA、十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基、明胶培养基、麦芽糖、木糖微量发酵管、硝酸盐培养基、枸橼酸盐培养基、葡萄糖蛋白胨水、肉汤培养基等。1%盐酸二甲基对苯二胺（氧化酶试剂）、硝酸盐还原试剂、吲哚试剂、3%过氧化氢、氯仿、1mol/L的盐酸3其他 接种环、接种针、载玻片、革兰染液、香柏油、擦镜液、生理盐水。步骤和方法一、样品的前处理1.亲水性样品（水包油型）：可取10g加到90ml带玻璃珠的灭菌生理盐水中，如样品量少于10ml，仍按10倍稀释法进行。如为5ml则加45ml灭菌生理盐水，混匀后，制成1：10稀释液。2. 疏水性样品（油包水型）：取样品10g先加10ml灭菌液体石蜡混匀，再加10ml灭菌的吐温80，在40-44水中振荡混匀10min，加入灭菌生理盐水75ml，在40-44水浴中乳化，制成1：10悬液。或用均质器，将加有助溶剂、稀释液的样品放入均质器，均质3-5min后，取上清液待检（上清液的稀释倍数为1：10）。3.膏、霜、乳剂半固体状样品1）亲水性样品取10g加到90ml带玻璃珠的灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡混匀，放30-32水浴中静置15min，用其上清液作为1：10的稀释液。2）疏水性样品称取10g，放到灭菌的研钵中，加10ml灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加10ml灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70ml灭菌生理盐水，在40-44水浴中充分混匀，制成1：10稀释液。4.固体样品：取10g加到90ml带玻璃珠的灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡混匀，放30-32水浴中静置15min后取出，充分振荡混匀，再放到30-32水浴中静置15min，取上清液作为1：10的稀释液。如有均质器，上述亲水性膏、霜、乳剂等，可称10g样品加90ml的灭菌生理盐水，均质1-2mi；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品加90mlSCDLP液体培养基，或1g样品加1ml灭菌液体石蜡、1ml灭菌吐温80、7ml灭菌生理盐水，均质3-5min。二、增菌培养：取1：10稀释样品10ml加入90mlSCDLP液体培养基中，置37培养18-24h，进行增菌。如有铜绿假单胞菌生长，则培养基表面有一薄层菌膜，培养液呈黄绿色或蓝绿色。三、分离培养：从増菌液的菌膜处挑去培养物，划线接种于普通营养琼脂平板、麦康凯平板、十六烷三甲基溴化铵平板和血琼脂平板上，经35孵育18-24h后观察菌落特征及色素等。本菌为专性需氧菌，在普通营养琼脂平板上形成圆形、大小不一、边缘不整齐、扁平、光滑、湿润而常呈融合状态的 菌落，琼脂被染成蓝绿色或黄绿色。在血琼脂平板上形成大而扁平、湿润、有金属光泽、有生姜味的 灰绿色或蓝绿色菌落，菌落周围出现的菌落呈有透明的溶血环。在麦康凯平板上形成微小、半透明菌落，48h后菌落中央常呈棕绿色。十六烷三甲基溴化铵平板具有较强的选择性，大肠埃希氏菌不能生长，革兰阳性菌生长较差而铜绿假单胞菌则生成无定型扁平菌落，向周边扩散或略有蔓延、表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。四、形态观察：将可疑菌落进行涂片革兰染色可见革兰阴性球杆状或长丝状，成双或成链排列。不染色标本动力观察，运动活跃；鞭毛染色，一端有1-3根红色的鞭毛。五、生化反应：将上述几个平板上的可疑菌落接种到各种生化培养基中。1.氧化酶、触酶试验、本菌均阳性。2.绿脓菌素提取试验：本来应该用专门的绿脓菌素培养基提取，但效果不如在十六烷三甲基溴化铵平板上提取，所以采用十六烷三甲基溴化铵平板，具体方法为在十六烷三甲基溴化铵平板中加入3-5ml氯仿，轻轻振摇2分钟左右，当氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移至另一试管中，并加入1mol/L的盐酸1ml左右，震荡片刻后静止，如上层盐酸层液内出现粉红色为阳性，表明有绿脓菌素的存在。3.42生长试验：挑去纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放41-42培养箱中，培养24-48h。铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。4.其他生化反应：铜绿假单胞菌的最后鉴定，主要根据生化反应特征，与嗜麦芽窄食单胞菌的生化区别如下表1。铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌主要生化反应结果 KIA 氧化酶 枸橼酸盐 硝酸盐产氮 吲哚 色素 葡萄糖 麦芽糖 木糖细菌 底层 斜面 产气 H2S铜绿假单胞菌 - - - - + + + - + + - +嗜麦芽窄食单胞菌 - - - - + - - - - + + -检验结果报告：被检样品经增菌分离培养后，在分离平板上有典型或可疑菌落生长，经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，可报告被检样品中检出有铜绿假单胞菌。如绿脓菌素试验阴性，而液化明胶、硝酸盐还原产气和42生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。