鲤鱼克隆及二级结构的预测与分析
n 更多资料请访问.(.)更多企业学院：./Shop/中小企业管理全能版183套讲座+89700份资料./Shop/40.shtml总经理、高层管理49套讲座+16388份资料./Shop/38.shtml中层管理学院46套讲座+6020份资料./Shop/39.shtml国学智慧、易经46套讲座./Shop/41.shtml人力资源学院56套讲座+27123份资料./Shop/44.shtml各阶段员工培训学院77套讲座+ 324份资料./Shop/49.shtml员工管理企业学院67套讲座+ 8720份资料./Shop/42.shtml工厂生产管理学院52套讲座+ 13920份资料./Shop/43.shtml财务管理学院53套讲座+ 17945份资料./Shop/45.shtml销售经理学院56套讲座+ 14350份资料./Shop/46.shtml销售人员培训学院72套讲座+ 4879份资料./Shop/47.shtml黑龙江野鲤核糖体内转录间隔区（ITS-1）的克隆及二级结构的预测与分析基金项目：农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室开放基金项目（BZ2009-05）;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项基金（中国水产科学研究院淡水渔业研究中心）（2007JBFB04）作者简介：钟立强（1985 - ）, 男 , 江苏高邮人 , 硕士 , 主要从事水产动物遗传育种研究。（Email）stevezhong1985163. 通讯作者：朱健, （Email）zhujffrc. 钟立强1,2，张成锋2，蔡生力1，刘红1，李冰2,3，朱健1,2,3（1. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306； 2.农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏 无锡 214081；3.南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214081）摘要： 【目的】黑龙江野鲤是我国北方重要的养殖鱼类，分析和了解其遗传结构对鲤鱼种质资源的保护和遗传性状的改良具有重要的意义。【方法】对黑龙江野鲤(Cyprinus carpio haematopterus)核糖体内转录间隔区 (ITS-1)进行了克隆测序，并对 ITS-1序列进行了分析。【结果】结果显示，所克隆的黑龙江野鲤ITS-1序列长度为365 bp，其中 A、T、G、C 4种碱基的含量分别为21.4%、12.3%、34.0% 和32.3%；与从GenBank中检索到的6种鲤科鱼类的ITS-1序列相比较，相似性较低，介于24.9% 59.5%之间；同时利用最小自由能原理预测了7种鲤科鱼类ITS-1序列的二级结构，并分析了其结构特点。【结论】根据鲤鱼与其他6种鲤科鱼类的ITS-1序列的同源性构建NJ系统进化树，所得的分类结果与传统的分类结果基本一致。在ITS-1序列的二级结构中，微卫星序列主要分布于环和凸起部位，并导致了核苷酸变异和序列长度差异。一、二级结构相结合将是研究物种分子系统学的重要手段关键词：黑龙江野鲤 (Cyprinus carpio haematopterus)；内转录间隔区 1(ITS-1); 基因克隆; 二级结构Cloning and secondary structure analysis of the rDNA internal transcribed spacer 1 in Cyprinus carpio haematopterusZHONG Li-qiang 1,2，ZHANG Cheng-feng 2，Cai Sheng-li 1，Liu Hong 1，LI Bing 2,3, ZHU Jian1,2,3(1. Fisheries and Aqua-life science College, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Key laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Science, Wuxi 214081, China; 3. Fisheries College, Nanjing Agriculture University, Wuxi 214081, China)Abstract: Cyprinus carpio haematopterus was an important freshwater fish in North China. Analyzing and understanding its genetic structure is helpful to the protection of wild germplasm resource and the improvement of genetic traits.The internal transcribed spacer 1 (IST-1) from Cyprinus carpio haematopterus was cloned, sequenced and analyzed. The result showed a sequence with total length of 365 nucleotides of ITS-1. The contents of A, T, G and C in ITS-1 of Cyprinus carpio haematopterus were 21.4%, 12.3%, 34.0% and 32.3% respectively. Comparing to ITS-1 sequences of the other 6 Cyprinine fishes in GenBank, there were lower homologies from 24.9% to 59.5% between Cyprinus carpio haematopterus and other fishes. Based on the sequences, the secondary structures of rDNA ITS-1 in Cyprinus carpio haematopterus and other 6 Cyprinine fishes were predicted according to the principle of minimizing free energy, structural characteristics were also analyzed. The evolution tree built from the ITS-1 homology of the 7 Cyprinine fishes was consistent with that of traditional taxonomic results. Simple sequence repeats (SSRs) located in loops and bulges, were responsible for most of the observed nucleotide variability and length difference. Combined nucleotide sequence with secondary structure will be a important way to study Molecular Systems Biology.Key words：Cyprinus carpio haematopterus；internal transcribed spacer 1；molecular clone；secondary structure鲤鱼是我国重要的淡水养殖鱼类,其养殖历史悠久，养殖范围广阔。在自然变异的基础上经过多年的人工选育,我国各地获得了多个具有明显杂种优势的杂交鲤鱼品种1，而黑龙江野鲤具有较强抗寒能力，因此分析和了解其遗传结构对鲤鱼种质资源的保护和遗传性状的改良具有重要的意义。核糖体内转录间隔区 (ITS-1)介于核糖体 DNA (rDNA)的18S和58S之间，是非编码区序列，最终不加入成熟核糖体，其受到的选择压力较小，进化速度快，能提供比较丰富的核苷酸变异位点和信息位点，适合物种间和种群水平上的系统发生研究2-7。自20世纪七十年代末 DNA 序列测定开始以来，关于核糖体RNA及其邻近区域的二级结构研究不断深入8。利用最邻近能量参数的自由能最小原理进行RNA二级结构的预测工作开始于Tinoco等9,10。经过一系列对动态计算方程的研究，二级结构预测的方法越来越有效11-14。本研究对黑龙江野鲤核糖体 ITS-1进行了克隆和测序，并将其ITS-1序列和 6种鲤科鱼类进行了对比分析，同时利用最邻近能量参数的自由能最小原理对其RNA的二级结构进行了预测，旨在了解其核糖体的分子遗传背景，同时为进一步开展鲤鱼遗传变异和鲤科鱼类系统进化的研究提供基础资料。1 材料与方法1.1 实验材料黑龙江野鲤10尾样品来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖场。Gel DNA purification Kit（胶回收试剂盒）、pMD19-T载体质粒、Taq DNA聚合酶和蛋白酶K均购自宝生物 (大连)有限公司。1.2 基因组DNA提取剪取黑龙江野鲤尾鳍150 mg左右，加入500 L裂解液（0.5% SDS，200 g/mL 蛋白酶 K，0.2 mol/L EDTA pH8.0），55 消化 34 h， 然后用酚、氯仿和异戊醇混合液（25241）抽提2次，75%乙醇洗涤，自然干燥后加 100 L 1TE (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) 溶解。4 保存备用。DNA浓度、质量用分光光度仪（Unico UV-4802H）和1% 琼脂糖凝胶电泳检验。1.3 PCR扩增及序列测定参照GenBank中金鱼(Carassius auratus)、欧鳊(Abramis ballerus)等鲤科鱼类核糖体序列，设计引物：ITS-1F 5CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG3；ITS-1R 5 AGTGATCCACCGCTAAGAGTTG 3，引物由上海生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系为50 ul：模板DNA 50-100 ng；2PCR Mix 25 ul；上、下游引物（10 mol/L）各1 l，其余体积用水补足。反应条件为：94 预变性2 min，94 变性45 s，60 退火1 min，72 延伸1 min，经35个循环后再72 延伸10 min。扩增产物电泳确定目的条带，用Gel DNA purification Kit（胶回收试剂盒）纯化回收，与pMD19-T Vector 16 过夜连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5 感受态细胞中，经蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，转至配好的PCR体系溶液中，进行PCR扩增，电泳检测并筛选阳性克隆转化子。菌液送至上海生工生物技术有限
