IPTG诱导表达蛋白步骤 .
IPTG诱导表达蛋白步骤15-11-3配固体培养基和液体培养基,灭菌。配BindingBuffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液pH值至7.4,定容后转到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤(滤除溶液内的气泡和不溶性杂质)。倒板:(5个灭菌的培养皿)微波加热溶解固体培养基(每次加热30s待有沸腾的迹象时,减少加热的时间)。超净台操作,以11000的比例(1ml培养基1l抗生素)向培养基中加入Kan+(50mg/ml),摇匀。倒板。培养皿放置在超净台上凝固,凝固后将培养皿倒着放入培养箱中15-11-4热转化:(将质粒导入大肠杆菌中)提前将大肠杆菌(冰上融化)和质粒拿出来融化,混合(冰上操作)后冰上放置30min。42热水浴1min(超过90s会损伤细菌),取出后立即放在冰上冷却23min,加入1mlSOC培养基。摇床上摇45min,150rp,37。(使菌体复苏)离心,3000rpm3min。涂板:取200l上述液体,喷到板上,用玻璃涂布棒涂匀,放入培养箱中30min晾干后倒着放置。(1216h)15-11-5配IPTG(0.2g/ml),用灭菌水,超净台操作。挑单克隆:将细菌放入培养液中,以便进行扩大培养和后续实验)提前准备好几支装有3ml培养基的试管,每管加入3lKan+抗生素(50mg/ml),塞好塞子,试管倾斜,是抗生素溶入培养液中。(塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌)。小镊子过火灭菌后,夹取一个枪头,在培养皿上挑一个单个的菌落,轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中,塞好塞子(试管中培养基液澄清)将试管放在摇床中培养一晚,37,250rpm。(尽量不超过12h)【试管中培养基液变混浊】注意:操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。15-11-6扩大培养、诱导表达以(抗生素培养基)11000的比例向培养基中加入Kan+抗生素,摇匀后再加入(100ml培养基)1ml单克隆溶液,摇匀。摇床上放置2.5h,37,180rpm以48lIPTG/100ml培养基的比例加入IPTG诱导,移去牛皮纸,恒温摇床上摇6h,30,180rpm。冰上放置一晚(抑制细胞生长速率,有利于蛋白质充分折叠)15-11-6 离心收集细菌:将培养液倒入 50ml 离心管中, 8000rpm, 离心 5min , 弃上清。沉淀加水冲洗混匀,再离心,弃上清。加 PBS 冲洗混匀, 离心,弃上清。加 PBS 混匀,将溶液移入 PU 管中, -20 保存。 15-11-7 破碎、离心细胞 4ml 细胞液用超声破碎 34 次(探头不能碰到管底和管壁,且 离管底 1cm 左右 ,47ml ) ,至溶液透明。 将溶液分装到 1.5ml 离心管中, ( 10000rpm , 4 ,1015min ) 离心23 次至没有白色沉淀。 蛋白质纯化脱盐 离心后得到的上清液用针筒抽取过膜, 先后用镍柱纯化、 脱盐 柱脱盐(柱子不能干,不能有气泡) 。